陳敏捷 鐘征翔

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率在全球范圍內成快速上升趨勢。2014年WHO公布的全球惡性腫瘤統(tǒng)計資料顯示，胰腺癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中居第13位，但其病死率卻高居第4位[1]。國內的調查顯示，胰腺癌發(fā)病率位列我國惡性腫瘤的第10位，病死率居第6位[2]。確診胰腺癌的患者1年生存率＜10%，5年生存率＜5%，是預后最差的惡性腫瘤之一[3]。隨著手術、化療、放療技術進步，胰腺癌診治水平有了很大提高，但整體預后仍未得到明顯改善[4]。胰腺癌患者的預后不良與術后短時間內復發(fā)轉移密切相關[5]，胰腺癌經常經血運轉移至肝臟、肺、骨骼等遠處器官。因此，早期發(fā)現外周血中是否存在微轉移，加強對胰腺癌復發(fā)與遠處轉移的監(jiān)測和治療是改善患者預后的重要手段[6]，但臨床上缺乏高靈感度與特異度的血液指標來判斷早期胰腺癌復發(fā)與轉移，腹部彩超、CT等影像學檢查效果也欠佳。

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指自發(fā)或因操作由原發(fā)病灶或轉移病灶釋放進入外周循環(huán)的腫瘤細胞，它可定植在遠處組織并形成新的轉移灶。這些轉移灶的腫瘤細胞表型和表達譜與原發(fā)灶相似，因此CTCs作為原發(fā)腫瘤的“液體活檢標本”可為實時、無創(chuàng)的監(jiān)測腫瘤發(fā)展提供條件。近年來，隨著CTCs富集及鑒定技術不斷發(fā)展，CTCs在惡性腫瘤復發(fā)與轉移過程中的研究越來越受到重視。研究顯示，CTCs檢測在乳腺癌、肺癌、結直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中具有早期診斷、檢測復發(fā)與轉移、制定個體治療方案及判斷預后等臨床價值[7-9]。本文系統(tǒng)地回顧近年來的研究報道，就CTCs富集、鑒定方法及CTCs檢測在胰腺癌診治中的應用研究進展綜述如下。

1 CTCs的富集

CTCs在外周循環(huán)中及其罕見[10]，研究時通過靈敏的方法濃縮富集CTCs是不可缺少的步驟。目前主要的富集方法有：基于物理學特征（大小、密度、電荷等）的密度梯度離心法、膜濾過富集法等；基于生物學特征（細胞表面蛋白等）的免疫富集法。

1.1 物理學富集法 密度梯度離心法是基于血液中各種細胞密度各不同的特點從而分離腫瘤細胞的一種技術。其分離的關鍵是高質量的分離介質。目前主要的分離介質有PtiPrep分離液、Percol分離液、Ficoll分離液及OncoQuick分離液等，其中后兩者較為常用。一項對比研究顯示，Ficoll與OncoQuick富集效率相似，均為70%～90%，但后者的靈敏度較前者有189倍的大幅度提高，單核細胞去除得以簡化，其特有的滲透性屏障可防止富集后的細胞移入其他組分[11]。美中不足的是，OncoQuick需要的血液樣本量較大，約15～30ml，總體的靈敏度與特異度仍較低，限制了其進一步應用。

膜濾過富集法是利用腫瘤細胞體積大于外周血細胞的原理建立的分離方法，如ISET分離法、ScreenCell分離法等。Vona等[12]提出的ISET分離技術通過設計濾過膜的孔徑富集CTCs，大多數研究報道濾過膜孔徑在8μm大小時，濾過效果較好。但并非所有的腫瘤細胞直徑均＞8μm，且血細胞的直徑也并非均＜8μm，因此該方法特異性較差，易導致腫瘤細胞丟失與假陽性的發(fā)生。

總體來說上述基于物理學的CTCs富集方法優(yōu)勢在于操作簡單、方便，成本較低，獲取的腫瘤細胞保留活力，方便后續(xù)的細胞形態(tài)觀察和分子生物學檢測；但這些方法特異度和敏感度均較差，極易出現腫瘤細胞的丟失，出現假陰性或其他血細胞及正常人體脫落細胞的干擾出現假陽性，獲得的腫瘤細胞純度低，使得應用受到限制。

1.2 免疫學富集法 免疫學富集法是基于上皮源性的惡性腫瘤均表達上皮黏附因子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和細胞角蛋白（cytokeratins，CK）等標記物的特點，依賴抗原-抗體特異性結合獲取腫瘤細胞的方法。其中代表性的方法有：免疫磁珠分選法、CTC-Chip法。

免疫磁珠分選法利用CTCs表面標記物EpCAM可與連接有免疫磁性微球的特異性單抗相結合，形成“抗原-抗體-磁珠”復合物，在外加磁場作用下吸附復合物，富集靶細胞；其包括陰性富集法及陽性富集法。目前應用范圍較廣的CTCs富集方法，如免疫磁性細胞分選儀(MACS)、CellSearch系統(tǒng)和AdnaTest癌細胞檢測系統(tǒng)等均基于此法。其中CellSearch是唯一通過美國FDA批準用于臨床乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌的CTCs檢測與分析的系統(tǒng)[13]，運用該系統(tǒng)在胰腺癌CTCs研究中也取得了一定進展[14-15]。

CTC-Chip法技術是居于微流體芯片的基礎上，在微流通道表面包覆了78 000個EpCAM抗體位點，在血液樣本進入芯片后，通道表面抗體通過抗原-抗體反應捕獲CTCs。Nagrath等[16]用CTC-Chip檢測15例胰腺癌患者均發(fā)現CTCs，數量在9～831個不等。第二代CTCChip芯片又稱為幾何增強混合芯片（GEM-Chip），其在一代芯片的基礎上設計了一種小室流動槽，可使樣品流體快速混合，顯著提高捕獲細胞的數量，研究人員還在血液樣本中捕捉到4～12個CTCs群，這是其他CTCs分離方法從未報道過的[17]。為進一步檢測研究腫瘤細胞群，研究團隊據此研發(fā)出一種用于捕捉2個或2個以上CTCs組成細胞群的最新微流體裝置，名為Cluster-Chip，他們使用Cluster-Chip發(fā)現30%～40%的轉移性乳腺癌、前列腺癌及黑色素瘤患者存在腫瘤細胞群，并通過RNA序列證實了它們的腫瘤起源[18]。這使其可能成為檢測腫瘤細胞群特性、發(fā)現腫瘤干細胞、研究腫瘤復發(fā)轉移的新方法。

免疫學富集法使CTCs保留了細胞的完整性，靈敏度與特異度較高，所需血液樣本量也較少，易于重復測定。但CTCs存在異質性，且腫瘤細胞在轉化、演變及上皮間質化（EMT）過程中可能會丟失其表面抗原，因此該方法可能會導致CTCs的遺漏，產生假陰性。

2 CTCs的鑒定

目前的分離技術無法百分百的富集CTCs，仍有部分血細胞會混雜在樣本當中，因此有效的CTCs鑒定技術顯得格外重要。CTCs鑒定主要是通過檢測腫瘤細胞特異性表面標志物、分泌蛋白及基因等確定腫瘤細胞。常用的CTCs檢測技術有：細胞化學染色檢測法、核酸檢測法、免疫熒光細胞化學法（ICC）、熒光原位雜交技術（FISH）及酶聯(lián)免疫分析技術（EPISPOT）等。

2.1 細胞化學染色檢測法 細胞化學染色檢測CTCs是基于細胞內的酸堿性物質能與相應的堿或酸性染料結合，顯示出現不同顏色的原理，包括瑞士染色、吉姆薩染色、蘇木精-伊紅（HE）染色等。有研究對179例胰腺病變的患者利用吉姆薩染色方法檢測CTCs，發(fā)現除胰腺癌患者外周血存在異形細胞外，在其他胰腺病變患者的外周血中均能找到類似的異形細胞，且這些異形細胞與腫瘤細胞較難鑒別[19]。細胞化學染色檢測法操作簡單，成本較低，但單從形態(tài)學鑒定腫瘤細胞較為困難，易受血液中炎癥細胞、正常上皮細胞及病理科醫(yī)生水平等干擾，且腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤細胞脫落及在外周血中轉化演變過程中可能存在形態(tài)學的改變，這使其應用受到限制。

2.2 ICC ICC的基本原理是抗原-抗體結合反應，利用單克隆抗體與特異的腫瘤標志物結合，通過酶與底物反應顯色來判斷腫瘤細胞，能對腫瘤細胞進行定量、定性分析，是CTCs鑒定中應用最廣的技術之一。CellSearch系統(tǒng)的CTCs鑒定部分基于此法，它利用經典的 CK8/18/19、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、CD45 標志物組合對富集樣本進行檢測，將 CK8/18/19（+）、DAPI（+）、CD45（-）的定義為腫瘤細胞[20]。目前ICC已在胰腺癌CTCs中廣泛使用，較為常見的腫瘤標志物有：EpCAM、CK、CA19-9、波形蛋白（Vimentin）等[21-25]。ICC 鑒定 CTCs受人為因素干擾較少，多種標志物聯(lián)合檢測有效地提高了該方法的靈敏度與特異度。但由于一些良性上皮增殖性疾病、手術、炎癥和組織創(chuàng)傷均可導致上皮細胞進入外周血，這些細胞表面存在同樣上皮特異性抗原，易導致假陽性的發(fā)生；同時在腫瘤EMT及轉化演變過程中，CTCs表面特異性標志物減弱甚至丟失，導致假陰性的發(fā)生。隨著對CTCs異質性的進一步研究，特異性腫瘤免疫標志物的出現，該方法在CTCs鑒定中必有廣闊的前景。

流式細胞技術（FCM）是一項以細胞熒光化學及單克隆抗體技術為基礎，集激光、電子物理、光電測量、計算機為一體的新型技術。其可以定量計數腫瘤細胞數量，檢測數據較精確，還可對細胞進行多參數分析。但其檢測成本較高，且FCM檢測靶細胞的靈敏度為1/1～10萬，但外周血中CTCs數量常＜1/100萬，故CTCs數量一定程度上限制了FCM在此領域的應用[26]。近年來在此基礎上發(fā)展出了許多改良技術，如光纖陣列掃描技術（FAST）、鐳射掃描細胞技術（LSC）、自動細胞顯像系統(tǒng)（ACIS）等大大提高了免疫熒光鑒定效率。Hsieh等[27]利用FAST對3份加入10～21個結腸癌HT-29細胞的血液標本進行檢測，靈敏度達到98%。

2.3 核酸檢測法 通過檢測腫瘤細胞的特異性遺傳物質來鑒定CTCs存在，如原癌基因、抑癌基因突變、染色體重排、微衛(wèi)星不穩(wěn)定及致瘤病毒序列等。聚合酶鏈式反應（PCR）一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術。癌基因的表達增加和突變在許多腫瘤早期和良性的階段就可出現，PCR技術不但能有效地檢測基因的突變，而且能準確檢測癌基因的表達量，可據此進行腫瘤早期診斷、分型、分期和預后判斷。但因大多數實體腫瘤DNA變化不明顯，且游離DNA不能明確就是腫瘤細胞來源，所以PCR檢測CTCs有待進一步研究。

逆轉錄-集合酶鏈式反應（RT-PCR）是在PCR的基礎上擴增有腫瘤特異性mRNA序列逆轉錄的DNA片段的方法，它可識別腫瘤細胞特異性的mRNA。該技術靈敏度高，可在107～108個外周血單核細胞中檢測出單個腫瘤細胞，但是由于核酸起源不明確，RT-PCR檢測CTCs時，結果可能會出現假陽性，影響檢測的特異性。為提高檢測的特異度和靈敏度，研究者使用免疫磁珠與RT-PCR 聯(lián)合多個 mRNA（hTERT、C-MET、CK-20及CEA）鑒定CTCs，陽性率顯著提高[28]。近年來，實時定量探針-PCR（QPCR），熒光定量-PCR（FQPCR）、巢式定量-PCR等新方法的出現，顯著提高了擴增效率和檢測靈敏度，目前應用較廣泛，是檢測鑒定CTCs的有效手段。

2.4 FISH FISH是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態(tài)和分布，或者是結合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位。Zhang等[29]依靠免疫磁珠富集胰腺癌CTCs后聯(lián)合CK、CD45、DAPI熒光染色及CEP8熒光探針法鑒定CTCs，其將CK+CD45-DAPI+CEP8=2，CK+CD45-DAPI+CEP8＞2 和 CK-CD45-DAPI+CEP8＞2定義為CTCs，診斷胰腺癌的靈敏度為68.18%，特異度為94.87%。FISH在CTCs診斷上特異性較高，但其檢測成本較高，探針設計不合理，環(huán)境樣品干擾等可能導致假陽性的發(fā)生。

2.5 EPISPOT EPISPOT是另一種基于檢測腫瘤細胞分泌的特異性標志蛋白的免疫方法。在該技術中，細胞分泌蛋白直接與載破片上特定熒光抗體結合，檢測CTCs的存在。通過檢測 CK19、Her2、MUC1、ERFR 等位點，已在乳腺癌、結直腸癌、肺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中得到應用[30-31]。此法可以驗證CTCs的活性，還能檢測腫瘤形成的分泌蛋白，對腫瘤復發(fā)轉移的相關性研究具有重要的意義。但該法檢測靈敏度低，無法估計CTCs的數量，應用于CTCs檢測的可行性還需進一步研究驗證。

3 CTCs檢測在胰腺癌診治中的應用

3.1 CTCs檢測在胰腺癌診斷中的應用 目前臨床上缺乏有效的血液標準判斷早期胰腺癌，腹部彩超、CT等影像學檢查效果欠佳。研究顯示，在腫瘤形成早期癌細胞就可以從原發(fā)灶脫落或經EMT進入外周血[32]，因此作為“液體活檢”檢測CTCs可能可以提高腫瘤早期的診斷效率，甚至監(jiān)測癌前病變預測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。劉艷輝等[33]采用免疫磁珠結合免疫熒光方法對胰腺癌患者進行檢測，CTCs的檢測率為88.41%，且CTCs的檢出情況和血清CA19-9升高水平具有相關性，認為CTCs檢測可提高胰腺癌的診斷率。Rhim等[34]在胰腺導管內乳頭狀黏液腫瘤（IPMN）中也成功檢測出CTCs，并指出CTCs是可預測胰腺癌的診斷指標。Kurihara等[35]在胰腺癌與腫瘤分期的研究中顯示隨著腫瘤分期升高，CTCs檢測率和數目逐漸升高，推斷CTCs能成為腫瘤分期中一項重要的參考數據。

3.2 CTCs在腫瘤復發(fā)、轉移中的應用 手術切除是早期胰腺癌的主要治療手段，復發(fā)和轉移是手術治療失敗的主要原因，也是影響患者生存期的重要因素，監(jiān)測腫瘤術后早期復發(fā)和轉移成臨床亟待解決的問題。在一項乳腺癌的研究中表明，CTCs檢測有助于早期微轉移及術后復發(fā)轉移的診斷，尤其是對那些腫瘤較小，在影像學不能清晰顯示的微轉移瘤有重要臨床價值。Tanaka等[36]檢測肺癌CTCs，分析發(fā)現CTCs水平與腫瘤遠處轉移具有相關性，發(fā)生轉移者CTCs數目增多，其檢測率的敏感性及特異性分別為71%和83%。張建偉等[37]利用免疫磁珠結合免疫熒光檢測83例胰腺癌手術患者CTCs，結果顯示CTCs數量與淋巴結轉移具有相關性（P=0.027，logistic回歸分析）。CTCs與胰腺癌早期微轉移及術后復發(fā)轉移的相關性及機制還有待進一步研究。

3.3 CTCs檢測在指導胰腺癌化療中的應用 化療是胰腺癌除手術之外的主要治療手段之一，但化療患者生存率仍＜5%[38]。在化療前后監(jiān)測CTCs變化可進一步揭示腫瘤對化療藥物的抗藥性并預測化療效果[39]。Torphy等[40]建立胰腺導管腺癌小鼠模型，隨機分為化療組與空白組，計數治療前后CTCs變化，化療組接受治療后CTCs數量明顯減少（26.61 vs 2.21，P=0.0207）。Ren等[25]對41例胰腺癌患者在接受5-氟尿嘧啶治療前后利用免疫熒光法進行了CTCs檢測發(fā)現，治療前有33例患者CTCs＞2個，在接受治療1周后這項數據減少到13例，這表明CTCs檢測可作為檢測藥效的指標。

目前根據胰腺癌患者組織學活檢特點，針對腫瘤細胞與腫瘤信號傳導通路的個體化治療備受關注。針對表皮生長因子受體（EGFR）的靶向治療藥物埃羅替尼（Erlotinib）已被美國FDA批準與吉西他濱聯(lián)合應用于胰腺癌一線治療的靶向治療藥物[41]。Toubaji等[42]對5例KRAS基因突變的胰腺癌患者相應的予以KRAS蛋白疫苗，結果顯示無進展生存期（PFS）為35.2個月，總生存期（OS）為44.4個月。除此之外針對胰腺癌鋅指蛋白217（ZNF217）、Hedgehog信號傳導通入等的研究也取得一定進展[43-44]。但由于藥物的使用、腫瘤的演變，可能使腫瘤基因型發(fā)生改變，無法定期獲取組織標本，使個體化用藥在一定程度上受到限制，而CTCs作為兩者之間的橋梁，能同時反映原發(fā)灶和轉移灶的性質[45]，其在個體化治療中有廣泛的應用前景。

3.4 CTCs在評估胰腺癌預后中的應用 胰腺癌進展快、預后差，但目前尚無有效評估其預后的指標。De Albuquerque等[46]利用免疫磁珠富集法聯(lián)合RT-PCR檢測34例胰腺癌患者外周血CTCs,并分析CTCs與PFS的相關性，CTCs陽性的16例患者PFS中位數為66d，CTCs陰性的患者PFS中位數為138d，其差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01）。Han等[47]對多個數據庫623例胰腺癌患者進行Meta分析，發(fā)現268例CTCs陽性，355例CTCs陰性，CTCs陽性組的PFS及OS較短。Chang等[48]通過微流控芯片聯(lián)合免疫熒光檢測63例胰腺癌患者循環(huán)微癌栓（CTM），其中51例檢測出CTM，在CTM與OS及PFS的相關性研究中顯示，CTM陽性患者對比CTM陰性的患者 OS（6.4 月 vs 19.8 月，P＜0.0001）及 PFS（2.7月vs 12.1月，P＜0.0001）較短。上述研究結果基本一致，外周血CTCs數量與胰腺癌PFS及OS顯著相關，提示CTCs可作為判斷胰腺癌患者預后的檢測標志物。但研究人員也指出小樣本單變量的CTCs檢測預測胰腺癌預后并無多大的統(tǒng)計學意義[49]，因此CTCs臨床應用價值仍需多中心、大樣本的研究加以確認。

4 小結

綜上所述，CTCs檢測在胰腺癌診治中具有廣闊的前景，探索分析CTCs對臨床研究胰腺癌意義重大。但目前的CTCs檢測尚處于科研階段，臨床應用還存在諸多問題，如（1）胰腺癌CTCs的富集方法較多，無統(tǒng)一標準，不同方法的富集效率參差不齊；（2）與乳腺癌、肺癌相比，胰腺癌缺乏特異性的腫瘤標志物，限制了CTCs的臨床檢測；（3）CTCs數量在胰腺癌的診斷、判斷轉移、分析預后中無定論，仍需要大規(guī)模多中心的研究；（4）對于早期CTCs陽性的患者如何進行下一步診治仍需進一步探索；（5）胰腺癌腫瘤干細胞的研究尚處于瓶頸階段；（6）痕量的CTCs體外培養(yǎng)可行性還需進一步研究；（7）基于胰腺癌CTCs的分子靶向治療還有待進一步開發(fā)研究。因此，在進一步改善方法學研究胰腺癌CTCs數量與臨床關系的同時，關注CTCs本身的基因表型，探索CTCs異質性將會是未來研究的重點。

相信隨著現代生物科學技術的不斷發(fā)展，對胰腺癌CTCs的研究不斷深入，作為可替代侵入性組織活檢的“液體活檢”，CTCs檢測將為胰腺癌的早期診斷、監(jiān)測復發(fā)轉移、制定個體治療方案及判斷預后等提供新思路。

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