潘紅燕

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310008）

糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored protein，GPI-APs)是一類通過(guò)其羧基末端的GPI結(jié)構(gòu)錨定于細(xì)胞膜表面而不跨越其磷脂雙層結(jié)構(gòu)的蛋白。[1]在脊椎動(dòng)物，真核生物，植物，軟體動(dòng)物，昆蟲(chóng)，血吸蟲(chóng)病，真菌和原生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了大量的GPI-AP[2]。目前，GPIAP主要用于細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)及相關(guān)疾病的研究。例如，IL-12基因與GPI信號(hào)肽序列的融合為初步制備腎癌疫苗奠定了基礎(chǔ)[3]；B7-1和GPI-AP的剪接和相關(guān)細(xì)胞的融合可以促進(jìn)T細(xì)胞的活化。從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以達(dá)到治療目的[4]。GPI-APs還可錨定CD等細(xì)胞因子，促進(jìn)T細(xì)胞活化，從而介導(dǎo)抗腫瘤[5]。

1.GPI-APs的分子結(jié)構(gòu)

GPI錨定蛋白的基因位于第19號(hào)染色體，基因跨度大于40kbp，包括18個(gè)內(nèi)含子，17個(gè)外顯子[6],全長(zhǎng)蛋白約56kD，是一個(gè)與多種疾病相關(guān)的多功能蛋白。GPI-APs廣泛分布于各類生物體內(nèi)，它含有大約20個(gè)氨基酸的組成的特殊C末端序列，該序列即為膜鉤連接的標(biāo)志，從而能將蛋白質(zhì)錨定于細(xì)胞膜表面，但不跨越膜結(jié)構(gòu)，從而不干涉細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞[7]。研究認(rèn)為[8]，GPI-APs和其他脂化蛋白是與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)的，這些蛋白質(zhì)大部分分布于細(xì)胞膜的脂筏上，可看作是膜相關(guān)的含脂雙層脂筏域的蛋白質(zhì)。因此，這些蛋白可通過(guò)質(zhì)膜的流動(dòng)性而定位于細(xì)胞的不同位置上，從而進(jìn)一步發(fā)揮其錨定蛋白本身的作用。

2.GPI-APs的生物學(xué)特點(diǎn)及功能

2.1 GPI-APs可與細(xì)胞膜可逆性結(jié)合

人體內(nèi)可水解GPI-APs中肌醇磷酸酯鍵的只有糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D(glycosylphosphatidy-linositol specific phospholipaseD,GPI-PLD)。目前發(fā)現(xiàn)，GPI-PLD基因可在多種組織細(xì)胞中表達(dá)，肝臟是其主要來(lái)源[9]。其可調(diào)節(jié)水解作用控制錨定蛋白的表達(dá)和發(fā)揮生理功能。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞膜上的GPI-APs可以被GPI-PLD洗脫，并釋放出完整的GPI-APs，發(fā)揮其作用。GPI蛋白同樣可以被去污劑從細(xì)胞表面洗脫，而當(dāng)游離的GPI分子再次與靶細(xì)胞或細(xì)胞膜共同孵育時(shí)，可自動(dòng)整合至細(xì)胞膜表面，并恢復(fù)其原有功能[10]。

2.2 GPI-APs參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)

GPI-AP主要參與細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞和環(huán)境之間的相互作用，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞粘附和補(bǔ)體調(diào)節(jié)等。GPI微域(GPI microdomain)是在細(xì)胞表面GPI錨點(diǎn)蛋白與鞘脂（包括鞘糖脂和鞘磷脂）、膽固醇、src家族蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）、G蛋白和細(xì)胞骨架蛋白和少量跨膜蛋白等組成的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的質(zhì)膜微區(qū)。GPI錨定的蛋白質(zhì)與這些組分相互作用以執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)[10]。

2.2.1 介導(dǎo)細(xì)胞胞飲作用 GPI-AP具有相對(duì)較長(zhǎng)的脂肪酸鏈，可以插入膜的細(xì)胞質(zhì)層，與細(xì)胞質(zhì)層中與信號(hào)分子相關(guān)的脂肪鏈相互作用，并誘導(dǎo)微區(qū)中細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)分子的重排，使Lck、Fyn等蛋白酪氨酸激酶在膜中重新分布并聚合。聚合的蛋白酪氨酸激酶可以通過(guò)彼此的酪氨酸磷酸化活化，進(jìn)而進(jìn)一步磷酸化下游分子酪氨酸，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并導(dǎo)致細(xì)胞胞飲作用[10]。

2.2.2 介導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化 研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞表面的許多蛋白質(zhì)通過(guò)GPI錨定在膜上，這些蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。當(dāng)T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor,TCR）以非共價(jià)鍵結(jié)合方式形成的TCR/CD3復(fù)合物缺陷時(shí)，交聯(lián)Thy-1和Ly-6的GPI-AP不能就引起T細(xì)胞增殖[7]。同樣，當(dāng)GPI-AP有缺陷時(shí)，TCR信號(hào)傳導(dǎo)和CD3的磷酸化水平都顯著降低，不能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖[11]?？梢?jiàn)，GPI-APs是淋巴細(xì)胞活化的重要信號(hào)分子。

2.3 GPI-APs參與蛋白生物活性的實(shí)現(xiàn)

每種免疫細(xì)胞都可表達(dá)特征性CD分子。研究發(fā)現(xiàn)，不少CD分子本身就是GPI-APs，還有些CD分子必須和GPI-APs相互作用才能實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。如，CD14分為膜結(jié)合型與游離型兩種，其中膜結(jié)合CD14就是GPI-CD14，它在巨噬細(xì)胞表面起到LDL受體的作用，可以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬LDL使其泡沫化[12]。

3.GPI-APs的臨床應(yīng)用

3.1 檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）

1996年，Kouskoff等[14]在小鼠雜交實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)后代小鼠中產(chǎn)生類似RA的多關(guān)節(jié)炎癥。Matsumoto[15]等發(fā)現(xiàn)TCR和致病免疫球蛋白識(shí)別的抗原是GPI。之后，人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中也發(fā)現(xiàn)相同的GPI抗體及高濃度GPI抗原。2006年，Schaller[16]等進(jìn)一步測(cè)定了不同RA患者血清和關(guān)節(jié)液中的GPI濃度，發(fā)現(xiàn)RA患者GPI總濃度較其它關(guān)節(jié)炎明顯升高。2008年，張迎梅等[17]對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的GPI濃度再次測(cè)定，更加證明了這一現(xiàn)象。

3.2 檢測(cè)腫瘤

GPI-APs可以作為腫瘤標(biāo)記物，以完整的GPI-APs形式存在于腫瘤細(xì)胞表面，也可以失去錨定形式存在于血清、尿液及分泌物中。GPI-APs與腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和凋亡的相關(guān)性甚高，其中包括某些細(xì)胞黏附分子（如N-CAM、T-Cadherin等）和/或細(xì)胞分化抗原（如CD24、CD48、CD52、CD58、CD66、CD67、CDw75、CD80、CD93、CD106、CDw108、CDwl09、CD157、CD160等）、某些受體（如CD14、CDI6B、CD87、硫酸乙酰肝素類蛋白聚糖glypican家族、GDNFR-α等）及其相關(guān)的配體或細(xì)胞因子（如GPI-80、ULBPs、RaeI、ephrin-A類等），還有某些酶類（如ADP-核糖基化酶、轉(zhuǎn)酰氨基酶、CD45等）[18]。GPI錨定蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但不同腫瘤涉及到何種GPI-APs的表達(dá)以及在腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段GPI-APs有何變化等問(wèn)題仍然尚未得到解決。

4.問(wèn)題與展望

從GPI-APs功能可以看出其可以幫助藥物直接作用于細(xì)胞而不影響細(xì)胞的正常功能，可將藥物或有利基因直接與GPI多肽序列基因拼接，導(dǎo)入細(xì)胞使其產(chǎn)生藥效或表達(dá)相關(guān)基因產(chǎn)物，從而達(dá)到治療腫瘤、心血管疾病等目的。也可將GPI與腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白連接，用于定位腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫識(shí)別和對(duì)腫瘤藥物的敏感性。GPI錨定不同性質(zhì)不同作用的蛋白質(zhì)，能在醫(yī)學(xué)生物學(xué)上發(fā)揮極大的作用。目前研究大多集中在GPI多肽序列基因與蛋白質(zhì)基因序列拼接、構(gòu)建新型GPI-AP基因，進(jìn)一步將新型GPI-AP基因?qū)胝婧宋⑸锘蛟宋⑸镞M(jìn)行體外表達(dá)，實(shí)現(xiàn)GPI-APs蛋白表達(dá)、增加藥物的敏感性和細(xì)胞的免疫識(shí)別等是廣大研究者所需努力的方向。

[1]李金斗, 錢晶, 丁佳欣,等.GPI錨定蛋白介導(dǎo)嵌合新城疫病毒樣顆粒的組裝[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2017, 37(6):969-975.

[2]楊智英, 唐建華. GPI錨定蛋白與白血病[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2009, 16(4):1325-1328.

[3] Zhao F,He X,Sun J,et al.Cancer stem cell vaccine expressing ESAT-6-gpi and IL-21 inhibits melanoma growth and metastases[J].American Journal of Translational Research,2015, 7(10):1870-1877.

[4 Wang L N,Gao M H,Wang B,et al.A role for GPI-CD59 in promoting T-cell signal transduction via LAT.[J].Oncology Letters,2018,15(4):4873-4881.

[5]唐建華, 譚超超. 糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白質(zhì)與腫瘤[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào), 2005,30(5):612-615.

[6] Muraki Y,Matsumoto I,Chino Y,et al.Glucose-6-phosphateisomerase variants play a key role in the generation of anti-GPI antibodies: possible mechanism of autoantibodyproduction[J]. Biochemi and Biophysi Res Communi, 2004, 323:518-522.

[7]許健, 牟一平, 樊擁軍，等.IL-18-GPI融合蛋白的表達(dá)及其免疫增強(qiáng)作用的研究[J]. 科技通報(bào), 2009, 25(4): 445-455.

[8] Castillon G A,Burriat-Couleru P,Abegg D,et al.Clathrin and AP1 are required for apical sorting of GPI-APs in biosynthetic and recycling routes in MDCK cells[J].Traffic,2018, 19(3):215-228.

[9]盧岳.糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D 基因表達(dá)與臨床相關(guān)疾病[J].Foreign Medical Sciences Section of Pathophysiology and Clinical Medicine,2004,24(2):138-141.

[10]葛蕙心, 張一兵, 李慧忠,等.GPI-B7-1錨定腎癌細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷自身腫瘤的促進(jìn)作用[J]. 山東醫(yī)藥, 2016,56(29):7-10.

[11]韓曉芳, 譚艷, 鄭啟煒,等. 葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)構(gòu)建類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)醫(yī)師雜志,2015, 17(6):842-845.

[12] Chan C F,Leung,Richard H,Posadas A,et al.High sensitivity 8-color flow cytometry assay for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria granulocyte and monocyte detections[J]. Biomedical Reports, 2018, 8(3):224-234.

[13]金躍, 張建明, 王書(shū)建，等.血清GPI抗原測(cè)定對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷的臨床價(jià)值[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(11):1328-1342.

[14] Kouskoff V,Korganow AS,Duchatelle V,et a1.Organspecific disease provoked by systemic autoimmunity[J].Cell,1996, 81:811-822.

[15] Matsumoto I,Staub A,Benoist C,et a1.Arthritis provoked by tinked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme[J].Science,1999,286: 1732-1735.

[16] Schaller M,Burton DR,Ditzel HJ.Autoanttbodies to GPI in rheumatoid arthritis:linkage between an animal model and human disease[J].Nature ImmunologY,2001,2(8):746-753.

[17]張迎梅,林寧姜,玉章，等.葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)檢測(cè)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診治中的應(yīng)用價(jià)值[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,23(4):77-79.