崔丹丹，楊瑞芳，佘瑋，李林林，蘇小惠，王繼龍，崔國(guó)賢

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，長(zhǎng)沙410128）

大麻（Cannabis sativaL.），別稱火麻、線麻，大麻科大麻屬一年生草本植物。工業(yè)大麻又名漢麻，是指四氫大麻酚含量低于0.3%的大麻品種。大麻是地球上最古老的作物之一，起源于中國(guó)，栽培利用歷史超過一萬年［1］。在中國(guó)，大麻的利用以紡織和食用為主。作為一種天然紡織原料，大麻纖維具有吸濕、散濕、透氣、消音吸波、耐熱、耐曬、耐腐蝕、抗靜電、防紫外線、抑菌等特點(diǎn)［2］，其產(chǎn)品受到越來越多消費(fèi)者的青睞；作為一種食用油，大麻籽仁油的不飽和脂肪酸含量高達(dá)88.54%以上［3］，人體自身不能合成的亞油酸和 α－亞麻酸在大麻籽油中的比例與人體的營(yíng)養(yǎng)需求十分接近［4］，其具有降壓調(diào)脂、改善消化系統(tǒng)、益智健腦、助睡眠、抗衰老等功效［5］。世界長(zhǎng)壽之鄉(xiāng)廣西巴馬地區(qū)的巴馬火麻油更有“長(zhǎng)壽油”的美譽(yù)，名揚(yáng)海內(nèi)外。在歐洲，超過95%的大麻籽作為動(dòng)物飼料（鳥食、釣餌），其余的用于以全麻籽形式生產(chǎn)的食物［6］。國(guó)外還使用稀酸／蒸汽聯(lián)合預(yù)處理工業(yè)大麻的方法來生產(chǎn)乙醇［7］。

多數(shù)大麻為雌雄異株，少數(shù)雌雄同株。因雄麻纖維質(zhì)量?jī)?yōu)于雌麻，生產(chǎn)上，若以收獲纖維為目的，則期望主要種植雄麻；若以收獲籽粒為目的，則期望主要栽培雌麻。但是，目前尚無準(zhǔn)確鑒定大麻種子性別的方法，幼苗期也較難分辨，且大麻的性別表達(dá)受多種因素影響，如溫度、光周期、激素、重金屬鹽等都能誘導(dǎo)大麻性別表達(dá)。不能根據(jù)收獲目的使大麻雌雄株合理搭配，嚴(yán)重制約了工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文概述了大麻種子鑒別、性別表達(dá)及雌雄株早期鑒定方法，以期為工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 大麻種子性別無損鑒定

在生產(chǎn)上使用的“大麻種子”實(shí)則為其果實(shí)，卵圓形瘦果，灰白或灰褐色，果皮堅(jiān)硬?！洱R民要術(shù)》有載，“凡種麻，用白麻子”，“止取實(shí)者，種斑黑麻子”，即顏色偏白，兩頭較尖，比較輕的種子是不結(jié)實(shí)的雄麻，而色較黑，比較堅(jiān)實(shí)而重的種子則是雌麻，所以，要收麻皮則用白麻子，要收種子則用黑麻子［8］；《農(nóng)政全書》有載，“種子取斑黑者為上”；《圖經(jīng)本草》有載，“農(nóng)家擇其子之斑黑文者，謂之雌麻，種之則結(jié)子繁，他子則不然也”。這些古代農(nóng)業(yè)書籍的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)均顯示，顏色較黑、籽粒飽滿的種子多為雌麻，顏色較淺，粒重較輕的種子多為雄麻。近年來，谷雨田［9］的研究也發(fā)現(xiàn)，大麻種子粒大飽滿多為雌株，反之，植株多為雄株。在種子重量與性別相關(guān)性研究方面，曲超等［10］對(duì)栝樓種子研究發(fā)現(xiàn)，隨著種子重量的增加，雄株分化比例減少，雌株比例增加。此現(xiàn)象可以從植物生理生化的角度解釋為：為了生殖生長(zhǎng)需要，雌麻種子需要儲(chǔ)存更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來抵御在生長(zhǎng)過程中可能遇到的各種生存壓力，使得雌麻種子重量高于雄麻種子。但是，這些經(jīng)驗(yàn)性的結(jié)論缺少足夠的科學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析支撐，因此，其區(qū)分雌雄大麻的準(zhǔn)確率有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

從重量差異角度考慮，在生產(chǎn)上，可使用風(fēng)選式種子篩選機(jī)或重力篩選機(jī)對(duì)大麻種子進(jìn)行分選，分選出的粒重飽滿者雌株比例高；從顏色差異角度考慮，可考慮色選，利用種子異色粒對(duì)特定光線的吸收或反射強(qiáng)度不同實(shí)現(xiàn)異色粒的分離，達(dá)到色選目的［11］。陳濤等［12］研究了棉花種子顏色分選自動(dòng)化系統(tǒng)，可以有效區(qū)分黑色與紅棕色棉花種子。

2 大麻性別表達(dá)的影響因素

2.1 遺傳因素

大麻性別由異型染色體（X和Y）決定，雄性為XY，雌性為XX。MoliterniVMC等［13］對(duì)大麻的性分化進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)?節(jié)的葉子出現(xiàn)時(shí)，大麻的生殖承諾可能會(huì)發(fā)生，在第4個(gè)節(jié)點(diǎn)的雄性和雌性存在差異表達(dá)。由此可見，工業(yè)大麻早期鑒定需在第4節(jié)葉子長(zhǎng)出后進(jìn)行，性別誘導(dǎo)應(yīng)在第4節(jié)葉子長(zhǎng)出前進(jìn)行。Dole?elJ等［14］對(duì)雌雄異株植物的核DNA含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)由于性別染色體異型性，雌性的DNA含量比雄性低。通過對(duì)大麻的DNA水平進(jìn)行檢測(cè)，得到一條長(zhǎng)約820 bp的與雌性性別連鎖的特異DNA片段［15］，若依據(jù)這些性別連鎖片段，通過轉(zhuǎn)基因等方式對(duì)其進(jìn)行表型標(biāo)記，培育出具有明顯辨別表型特性的大麻品種，則有利于實(shí)現(xiàn)雌雄植株的早期識(shí)別。

2.2 肥料對(duì)大麻性別表達(dá)的影響

大麻用肥主要為氮、磷、鉀及其他微量元素肥料，以及農(nóng)家肥等。留種用大麻增施磷肥有利于提高種子產(chǎn)量和質(zhì)量［16］。VanderWerf等［17］的研究表明，隨著氮肥施用量的增加，大麻雌株比例顯著增加。有人用8倍于克氏溶液的氮肥時(shí)，得到100%的雌株［18］。為了生殖生長(zhǎng)需要，雌麻需要具有更強(qiáng)的生命力以抵抗各種生存壓力，在氮肥使用過多時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生更多雌株。但是，氮肥促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，對(duì)生殖生長(zhǎng)有抑制作用，在生產(chǎn)上采用高濃度氮肥誘導(dǎo)雌株的方法顯然不可取。磷肥具有促進(jìn)開花結(jié)實(shí)，提升籽粒飽滿度的作用，可在作物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)前增施磷肥提高種子產(chǎn)量。

2.3 激素誘導(dǎo)大麻性別分化

Chailakhyan MK［19］早在1937年就提出，性激素調(diào)控植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到開花的轉(zhuǎn)變。隨著對(duì)各類植物激素研究的深入，其在促進(jìn)生命活動(dòng)，尤其是在性別表達(dá)中的作用逐漸被闡明。檢測(cè)激素和遺傳之間的相互作用機(jī)制及其在植物性別分化中的作用成為解決現(xiàn)代許多生物學(xué)難題的重要手段。細(xì)胞分裂素的作用表現(xiàn)在復(fù)制和翻譯水平，參與到tRNA與核糖體mRNA的復(fù)合；赤霉素表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平，通過誘導(dǎo)依賴細(xì)胞周期蛋白激酶基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期（DNA合成準(zhǔn)備期）向S期（DNA合成期）轉(zhuǎn)變。Khryanin VN［20］研究發(fā)現(xiàn)赤霉素與莖伸長(zhǎng)調(diào)節(jié)中幾個(gè)基因的關(guān)系，雌性植物組織中有一種特殊的細(xì)胞分裂素和一種特殊的蛋白，在雄性植物中卻不存在，且激素發(fā)揮作用的階段對(duì)植物的性別有很大影響。在許多草本植物中，花原基的發(fā)育及其性別分化與第3片葉片的發(fā)育是一致的。正因如此，在花分生組織形成后，植物激素對(duì)幼苗的處理并不能導(dǎo)致植株性別特征的改變［21］。這與Moliterni VMC［13］認(rèn)為大麻在第4個(gè)節(jié)的雄性和雌性存在差異表達(dá)有相通之處。據(jù)Herich R等［22］的研究，大麻種子浸泡在赤霉素中24 h可以誘導(dǎo)更多的大麻雌株。乙烯則利能誘導(dǎo)大麻雄株產(chǎn)生雌花［23］。

2.4 重金屬鹽對(duì)大麻性別分化的影響

研究者使用重金屬鹽（Pb（NO3）2，CuSO4和ZnSO4）對(duì)大麻的植物激素狀態(tài)和性別表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)銅鹽和鋅鹽誘導(dǎo)植物雌性化，并且這種作用與玉米素積累相結(jié)合，鉛鹽有利于植物雄性化以及GA（赤霉素）積累。因此，植物性別表達(dá)的變化與重金屬對(duì)植物激素、GA和玉米蛋白平衡的作用有關(guān)［24］。以硝酸銀和硫磺酸銀的陰離子絡(luò)合物為原料，在遺傳雌性大麻植物中誘導(dǎo)出了不育的雄花［25］。

3 大麻性別的早期鑒定方法

3.1 形態(tài)學(xué)水平

通過植物形態(tài)特征鑒定植株性別，簡(jiǎn)便易行，經(jīng)濟(jì)高效。大麻幼苗期，可根據(jù)葉片形狀判斷雌雄。據(jù)谷雨田［9］觀察，雌株葉片短而寬，葉色深綠；雄株葉片長(zhǎng)而尖，葉色淺綠。據(jù)此，可通過間苗期間苗來控制植株性別的比例，但水肥等其他因素會(huì)影響植株長(zhǎng)勢(shì)，故有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員判斷更為準(zhǔn)確。

3.2 生理代謝差異鑒別

研究［26］表明，雌雄株在氧化還原能力方面存在較顯著差異，雌性處于較還原狀態(tài)，而雄性處于相對(duì)氧化狀態(tài)，雌株幼葉較雄株有較多的過氧化物酶區(qū)帶。趙云云等［27］對(duì)銀杏雌雄株氨基酸組分及含量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)銀杏雌雄株的氨基酸平均含量有差異，雄株高于雌株，其中胱氨酸和酪氨酸含量較為突出。銀杏、楊梅、獼猴桃等樹種葉片水溶性酚類物質(zhì)總量雌株普遍高于雄株，且差異達(dá)到極顯著水平［28］。該方法因無具體量化指標(biāo)，且操作較為復(fù)雜，較難準(zhǔn)確判斷植株性別。目前，在大麻性別鑒定方面尚未有相關(guān)研究，可以借鑒銀杏等植物的研究方法，對(duì)大麻雌雄株生理代謝進(jìn)行深入研究。

3.3 化學(xué)物質(zhì)分析鑒別

根據(jù)不同性別葉片對(duì)不同濃度化學(xué)試劑顯色不同，彭子模［29］使用0.1%甲基紅溶液對(duì)浸提幼葉的上清液進(jìn)行染色，32℃水浴保溫，20 h后雌株出現(xiàn)明顯黃綠色，雄株為黃褐色。Andre C等［30］使用快藍(lán)B鹽對(duì)開花雌大麻的腺毛進(jìn)行組織學(xué)觀察，顯微鏡下，清楚地顯示了包裹著乳劑的頭部的薄角質(zhì)層，用快藍(lán)B鹽溶液處理，很容易觀察到淡紅色，結(jié)果還表明，該試劑在大麻雌株莖狀腺毛體中表現(xiàn)優(yōu)越。絞股藍(lán)苗期雌雄株鑒別則使用了0.1%BTB（溴麝香草酚藍(lán)）溶液，染色后10 h左右顏色有明顯差異，雌株的提取液為黃色，雄株為綠色。使用化學(xué)試劑染色鑒定植株性別，快速高效，且準(zhǔn)確性較高，是雌雄異株植物性別鑒定的常用方法［31］。

3.4 DNA分子標(biāo)記鑒別

特征序列擴(kuò)增區(qū)域（SCAR），是從隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性 DNA（RAPD）技術(shù)衍生而來，通過對(duì)RAPD片段克隆、測(cè)序、序列分析后設(shè)計(jì)出一對(duì)引物，互補(bǔ)到原來RAPD兩端的24堿基上［32］。用這對(duì)引物與原來的模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特征序列擴(kuò)增區(qū)域被特異性擴(kuò)增，結(jié)果穩(wěn)定可靠。采用SCAR標(biāo)志物對(duì)大麻進(jìn)行早期鑒定，用三甲基溴化十六烷基銨（CTAB）方法從中分離出DNA，使用MADC2（來自大麻的雄性相關(guān)DNA）引物作為標(biāo)記來鑒定大麻的性別。利用MADC2－F和MADC2－R引物擴(kuò)增基因組DNA，制備出兩個(gè)大小分別約為450 bp和300 bp的片段。在收獲用于脫氧核糖核酸外牽引的組織后，將花的外觀與DNA分析進(jìn)行比較，分子分析結(jié)果與雄花或雌花的外觀一致。說明疤痕標(biāo)記可以在非常早期鑒定大麻性別［33］。

4 對(duì)于大麻性別研究的展望

4.1 工業(yè)大麻種子無損鑒定

目前，在工業(yè)大麻種子性別無損鑒定方面的研究甚少，但水稻、玉米種子無損鑒定技術(shù)較為成熟。胡偉鳳等［34］使用色選機(jī)分選、色選與重力分選結(jié)合、色選與比重分選結(jié)合的方法研究了分選方式對(duì)雜交水稻種子活力的影響。在大麻種子分選及其性別鑒定中也同樣具有借鑒意義。鄧小琴等［35］采用融合光譜、紋理及形態(tài)特征的方法對(duì)水稻種子品種高光譜圖像單粒鑒別進(jìn)行研究，實(shí)現(xiàn)了水稻品種的單粒快速鑒別。蘇謙等［36］采用近紅外光譜方法實(shí)現(xiàn)玉米品種的快速鑒定，并對(duì)不同品種的玉米種子建立了相應(yīng)的鑒別模型。故可以考慮在對(duì)大麻種子進(jìn)行去雜、清選、精選后，借鑒此類檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)工業(yè)大麻種子的無損鑒定，同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)工業(yè)大麻種子顏色、紋理、形狀、光譜特性等方面的研究。

4.2 工業(yè)大麻無性繁殖

“中國(guó)草”苧麻在栽培中多采用扦插育苗。對(duì)工業(yè)大麻進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得既定性別的無性繁殖后代，按需求進(jìn)行雌雄株分開種植成為工業(yè)大麻發(fā)展的新方向。在人工快繁技術(shù)日新月異的今天，大麻無性快繁完全可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但是，扦插育苗的成本較種子直播高出數(shù)倍，降低扦插育苗成本是推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。故亟需配套的大麻幼苗栽培技術(shù)及大麻幼苗種植機(jī)械設(shè)備以減少勞動(dòng)力成本。優(yōu)良種質(zhì)、栽培技術(shù)與機(jī)械設(shè)備結(jié)合，才能更好推動(dòng)工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

4.3 工業(yè)大麻品種選育

工業(yè)大麻性別具有多樣性，生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)，雌雄同株品種表現(xiàn)良好且籽粒產(chǎn)量高，但遺傳極不穩(wěn)定，適應(yīng)性較差。因此，希望選育出遺傳穩(wěn)定、適應(yīng)性優(yōu)良的雌雄同株品種。但研究［37］認(rèn)為，雌雄異株是大麻進(jìn)化標(biāo)志，雌雄同株是返祖遺傳（生物體偶然出現(xiàn)的與祖先相似性狀）。植物進(jìn)化的方向是從雌雄同株進(jìn)化為雌雄異株，雌雄同株大麻品種的育種是逆進(jìn)化過程［38］。能否克服逆進(jìn)化過程阻礙，嚴(yán)格隔離育種，獲得能夠穩(wěn)定遺傳、廣泛適應(yīng)的雌雄同株品種成為今后工業(yè)大麻相關(guān)研究的又一挑戰(zhàn)。

4.4 工業(yè)大麻性別誘導(dǎo)技術(shù)

目前，對(duì)大麻性別誘導(dǎo)的研究主要在光周期、激素、化學(xué)試劑、重金屬鹽、肥料誘導(dǎo)等方面［39］。以上試驗(yàn)證明上述因素確實(shí)可以誘導(dǎo)大麻性別分化，但是因各種誘導(dǎo)方法都會(huì)受到其他因素的干擾，作用效果不穩(wěn)定，目前還沒有形成可以在生產(chǎn)上廣泛使用的相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。因此，亟需深入研究各因素對(duì)大麻性別誘導(dǎo)的方法，形成規(guī)范完善的技術(shù)體系供生產(chǎn)使用。

4.5 工業(yè)大麻性別分子標(biāo)記

利用大麻性別連鎖片段進(jìn)行分子標(biāo)記，通過轉(zhuǎn)基因等方式對(duì)其進(jìn)行表型標(biāo)記，培育出具有可以早期識(shí)別，有明顯辨別表型的大麻新品種。若能將性別連鎖片段在大麻子房壁細(xì)胞實(shí)現(xiàn)特異性標(biāo)記，則有望實(shí)現(xiàn)通過種子顏色（紋理等）鑒定工業(yè)大麻性別。