蔡則成 馬赫 戈朝暉

2017年，全球約有630萬例新發(fā)結(jié)核病患者，全球結(jié)核病的治療成功率約為83%[1]。骨與關節(jié)結(jié)核占患者總例數(shù)的5%左右，但是其中50%以上為脊柱結(jié)核[2]。近年來對于脊柱結(jié)核研究方向以藥物、內(nèi)置入物及緩釋材料居多[3]。在建立動物模型時，通常要達到一致性、反復性、穩(wěn)定性、實用性、可控性、易操作性和經(jīng)濟性。在落實到具體建立動物模型時，筆者就結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)菌株的配制、模型動物的選擇、致敏的重要性、手術方式、術后的檢測方向等加以闡述。

一、MTB菌株的實驗環(huán)境

1.實驗室條件：3級生物安全實驗室。

2.質(zhì)控標準：MTB的菌株應來源于中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collection，CMCC)或美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)或當?shù)氐慕Y(jié)核病研究所。

3.感染控制：嚴格按照3級實驗室生物安全規(guī)范與標準進行實驗操作，一旦發(fā)生MTB意外感染事件，當事人應盡快就醫(yī)，通報疫情，關閉實驗室及消毒場所，隔離相關人員，相關部門應立即啟動應急預案。

二、MTB懸液的配制

在脊柱結(jié)核動物模型的建立中，大多數(shù)采用的是MTB標準株H37Rv，同時也有用牛分枝桿菌作種植菌株，但是結(jié)果并不理想，在8周內(nèi)均未出現(xiàn)病變椎體的新生骨及硬化壁[4]。由于MTB的胞壁為疏水性，導致了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)難以滲透，決定了其為生長緩慢的菌株[5]。根據(jù)MTB的生長特性，已研究產(chǎn)生了十幾種培養(yǎng)基，但是臨床與科研上常用的有羅氏固體培養(yǎng)基和Sauton液體培養(yǎng)基兩種[6]。林旭[7]進行菌株培養(yǎng)時同樣采用的是上述兩種培養(yǎng)基，缺點為取成熟菌落的時間為14～21 d，時間較長且后續(xù)對膿液進行細菌培養(yǎng)也耗時較長。蘇明權等[8]在改良羅氏培養(yǎng)基的基礎上加入已研究好的促生長劑配方，進行了添加促生長劑與未添加生長劑之間MTB生長狀態(tài)的對比，發(fā)現(xiàn)菌株在含促生長劑的培養(yǎng)基上5～7 d即可形成肉眼可見的米粒狀菌落，而在普通培養(yǎng)基上需2周左右才形成。這種加入促生長劑的培養(yǎng)基可以在細菌培養(yǎng)及術后取材鑒定時為研究者節(jié)省時間。因MTB在培養(yǎng)基中的狀態(tài)為干燥顆粒狀，不便于攜帶及種植，故其應用于動物模型種植時均配置為MTB混懸液，方法為輕柔研磨，加入生理鹽水，常用的MTB濃度為5 mg/ml[9]，即1×10-7菌落形成單位(CFU)·ml-1。喬永杰等[10]通過不同的MTB混懸液濃度對于造模的成功率做了更為詳細的對比研究，從組織病理到影像學的表現(xiàn)，通過三組不同濃度的菌量進行實驗，發(fā)現(xiàn)1×10-6CFU·ml-1與1×10-8CFU·ml-1的死亡率及并發(fā)癥較高，而1×10-7CFU·ml-1可行性及成功率較高，但是作者只是設置了3組實驗，并未行更多不同濃度梯度之間的比較，導致樣本量過小。

三、模型動物的選擇

結(jié)核病的動物模型在微生物學鑒定、不同菌種的鑒別、細菌侵襲力的測定、病理學研究等均占有重要地位[11]。動物脊柱結(jié)核模型的建立需要產(chǎn)生與人類相似的病理變化，如病灶中軟組織的肉芽腫、膿腫形成，椎體中的死骨及骨缺損產(chǎn)生，以及能夠帶菌存活較長時間[12]。雖然研究者對很多不同種類的動物進行了建立結(jié)核模型的實驗，但是由于動物對MTB的敏感性、疾病的表現(xiàn)形式、個體解剖結(jié)構(gòu)均不相同，導致實驗的結(jié)果在不同的動物上差異很大。以下就常見的實驗動物做一些比較。

1. 豚鼠：豚鼠對MTB高度敏感，只需要低劑量的MTB菌量即可產(chǎn)生與人類相似的肉芽腫，繼而迅速發(fā)生液化壞死，故其肉芽腫的發(fā)生是進行性的，如不盡快加以干預，豚鼠的生存時間會非常短[13]。但是豚鼠對于卡介苗及抗結(jié)核藥物的反應非常敏感，故豚鼠是良好的疫苗研發(fā)和治療效果檢測的結(jié)核模型。因豚鼠自身解剖結(jié)構(gòu)的特點，體積小、椎體及椎板較薄、椎骨視野暴露困難，致使其適合以氣溶膠的形式被感染，多用于模擬免疫功能缺陷者感染MTB，以及研究結(jié)核感染引起的超敏反應所表達的蛋白[14]。

2.小鼠：小鼠價格低廉，繁殖率較高，CD4+和(或)CD8+T淋巴細胞在炎癥反應中表達明顯，適應力強，非常適合在3級生物安全實驗室中進行實驗。大多數(shù)小鼠通過低劑量的MTB氣溶膠進行感染，其他的感染途徑有靜脈注射、氣管內(nèi)注射等，多用于進行肺結(jié)核診治的實驗[15]。但是MTB并不是小鼠的自然病原體，所以小鼠對于MTB的敏感性并不高，這就導致小鼠可以攜帶大量的MTB而不表現(xiàn)出臨床癥狀的可能性[16]。Bai等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在感染MTB后巨噬細胞沒有分泌一種名為白細胞介素(IL)-32的抗MTB細胞因子，導致其肉芽腫的形成與人類有很大的差異。在高劑量的MTB感染后也可出現(xiàn)與人類相似的肉芽腫，但是會引起致敏T細胞與細胞因子對抗原的直接殺傷，導致小鼠死亡[18]。雖然小鼠有對MTB不敏感、病灶形成不典型等不足，但是小鼠對抗結(jié)核藥物的反應與人類很相似，并且轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生與人類相似的抗MTB的細胞因子；故小鼠多用于肺結(jié)核模型的建立，以及疫苗研發(fā)、抗結(jié)核藥物的實驗中[19]。高琪樂等[20]通過在混懸液中加入Matrigel Matrix基質(zhì)膠注射入骨孔內(nèi)，構(gòu)建出C57BL/6小鼠脊柱結(jié)核模型，但是存在成功率較低、骨破壞面積較小等缺點。

3.兔：兔對于不同型別的MTB均有不同的表現(xiàn)，例如MTB的Erdman和HN878型對于兔的侵襲力非常弱，在感染之后疾病進展非常緩慢，甚至可以見到未經(jīng)任何治療措施而痊愈的兔[21]；但是選用H37Rv標準株時可以觀察到與人類類似的結(jié)核病理變化、疾病進展、免疫反應的過程[22]。種植MTB時多用牛分枝桿菌與MTB，牛分枝桿菌感染后，兔會形成干酪樣壞死、局部液化，適用于組織病理學的研究[23]。兔在感染MTB后可出現(xiàn)較典型的結(jié)核病變，在脊柱種植后可出現(xiàn)椎間隙狹窄、骨質(zhì)破壞、寒性膿腫等典型病變，且兔的脊柱解剖很有特點，由椎體、椎板、上方的棘突、兩側(cè)的橫突構(gòu)成，形似三葉草，面積較大，適合進行鉆孔、病灶清除、放入內(nèi)置物等手術操作，但是因兔的椎體周圍血管較多、椎體矢狀徑過短，所以對手術操作要求較高，術中易出現(xiàn)大血管破裂和脊髓損傷等嚴重并發(fā)癥[24]。

4.非人靈長類動物：非人靈長類動物對MTB易感，且與人類的解剖、遺傳特征等相似，理論上可以成為最理想的動物模型[25]。恒河猴(Rhesus Monkey，RMs)已經(jīng)被證明是一種非常合適的結(jié)核病動物模型，其作為動物模型可以更容易地感染MTB，并且可以顯示人類所有的結(jié)核病特點，從急性感染和主動感染到無癥狀的潛伏性感染[26]。除此之外，食蟹猴(Cynomolgus Monkey，CMs)也是非常理想的模型。Sharpe等[27]通過超低氣溶膠感染的形式對兩種不同類型的猴進行對比試驗，發(fā)現(xiàn)RMs較CMs更容易感染MTB；故RMs多用于活動性結(jié)核病的研究，CMs可用于慢性或MTB潛伏感染的研究。但是迄今為止尚未見到用非人靈長類動物建立脊柱結(jié)核模型的報道。因其價格昂貴、飼養(yǎng)困難、容易引起疾病暴發(fā)等原因，故在結(jié)核病的研究中應用較少。

四、致敏的重要性

對于動物結(jié)核模型的建立，John于1913 年采用下肢動脈、門靜脈分支，甚至于心臟直接注射MTB及敷料吸附MTB塞入骨孔的方式建立骨關節(jié)結(jié)核的動物模型。令人遺憾的是，這種方法得到的模型存活率低且樣本的數(shù)量較少，但是為后面的研究者建立其他部位的結(jié)核模型提供了啟發(fā)。這些建立結(jié)核模型的過程中主要存在3個問題：(1)難以獲得指定部位的結(jié)核固定病灶或病灶產(chǎn)生不明顯；(2)MTB容易經(jīng)血液播散，以致還未進行實驗研究，動物就因全身性的MTB感染而死亡；(3)每種動物對于MTB的敏感性都是不同的。弗氏完全佐劑是一種從動物油脂中提取的乳濁液，相當于減毒疫苗，能夠誘導動物體內(nèi)產(chǎn)生MTB抗體，增強免疫力，防止結(jié)核感染而產(chǎn)生過強的免疫反應[28]。為了解決上述問題，Lindberg[29]在1967年率先采用已經(jīng)致敏的豚鼠，并在其股骨遠端干骺端鉆孔，置入明膠海綿并浸注MTB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)破壞和軟組織腫脹在不到2個月的時間即可形成，一并解決了上述的問題。Smith和Harding[13]提到豚鼠對于MTB敏感的特性，但是術前致敏卻可以提高存活率，這個現(xiàn)象提示了致敏對于建立模型的重要性。2002年吳啟秋等[30]在國內(nèi)率先將MTB直接注入兔膝關節(jié)腔內(nèi)，但是與之前不同的是，兔在實驗前已用弗氏完全佐劑致敏。此法成功建立了兔膝關節(jié)結(jié)核模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)致敏的兔MTB產(chǎn)生的擴散和免疫反應較前明顯降低，實驗兔存活時間長，可重復性強，為國內(nèi)建立結(jié)核模型兔提供了新的啟示。Liu等[31]采用的是術前1個月給實驗兔注射地塞米松，1周后改為地塞米松片劑喂服，但是脊柱結(jié)核的病理變化并不是很典型。2015年Geng等[32]對于建立脊柱結(jié)核模型兔的術前弗氏完全佐劑致敏與未致敏的兩種建模方式的成功率做了詳細對比，結(jié)果證實了術前致敏組的成功率高于未致敏組；但是縱觀各個研究，均未對致敏劑的劑量做出過詳細的解釋，以及致敏劑的用量是否與體質(zhì)量、年齡等因素有關，亦未見到有不同致敏劑的劑量與建模成功率的報道。

五、手術方式

對于兔脊柱暴露的方法主要有兩種，即經(jīng)側(cè)方與后方入路。大多數(shù)學者均采用王非等[33]的側(cè)方肌肉間隙入路的方法對兔的脊柱進行暴露，可以避免損傷腹膜、深入臟器等操作，但是后方入路也可以達到上述目的。王云玲等[34]對側(cè)方入路和后方入路做過比較后發(fā)現(xiàn)，側(cè)方入路較后方入路所誘發(fā)的結(jié)核癥狀出現(xiàn)的更早，術后MTB腹腔播散、竇道形成等并發(fā)癥更少，兔的存活率更高。在兔麻醉完成后，行右側(cè)臥位固定，常規(guī)消毒及鋪巾，經(jīng)橫突側(cè)腹部入路，顯露腰5～6椎體，于腰5椎體下部距腰5～6椎間盤0.5 cm處從左后方向右前方，用醫(yī)用骨鉆進行鉆孔，深度約5 mm，直徑3 mm，此即為側(cè)方入路顯露椎間盤與椎體。骨孔在充分止血后填充明膠海綿并壓實，用注射器在明膠海綿上緩慢浸注MTB混懸液0.1 ml，以能讓明膠海綿充分填充骨孔為宜。在完成填塞后，Guo等[9]主張用骨蠟封孔，但也有未進行封孔的方式。Geng等[35]在實驗中發(fā)現(xiàn)，若是骨孔過小、菌液有輕微溢出，則不必用骨蠟封孔，否則術后很容易脫落，造成MTB的播散，反之則可進行封孔。實驗中用的明膠海綿相當于MTB的載體，絕大多數(shù)研究者采用的是明膠海綿，但是高琪樂等[20]在實驗中采用了基質(zhì)膠，同樣達到了MTB種植的目的，這是一種對植入材料的新啟發(fā)。

六、術后的檢測方向

雖然尚未出現(xiàn)對于脊柱結(jié)核動物模型鑒定的統(tǒng)一標準，但是綜合前面的實驗研究，可以從影像學、病灶解剖、組織學染色、膿腫細菌培養(yǎng)等幾個方面進行檢測。(1)影像學：X線檢查可以發(fā)現(xiàn)病灶椎體有骨質(zhì)破壞及鄰近椎間盤變窄甚至產(chǎn)生后凸，但這些均是脊柱結(jié)核晚期的表現(xiàn)；CT可以在早期顯示椎旁膿腫、鈣化等病變，也可以清晰顯示死骨及硬化壁的形成；MRI對于脊柱結(jié)核診斷最為敏感，也是早期最準確的檢測方法，可以顯示脊髓受壓、椎旁肌肉水腫、膿腫形成等變化[36]。(2)病灶解剖：對動物模型的病灶進行解剖后可發(fā)現(xiàn)肉眼可見的膿腫，膿腫呈淡黃色、無臭味；其余部位如肺、心等未見MTB播散及膿腫形成。(3)組織學染色：取動物膿壁組織行HE染色可見較多的淋巴細胞、類上皮細胞，椎體標本切片HE染色可見骨質(zhì)破壞，骨小梁結(jié)構(gòu)消失，周圍為炎性肉芽組織。(4)膿腫細菌培養(yǎng)：取膿液標本進行MTB培養(yǎng)，可在培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)生長緩慢的淡黃色菌落[37]。綜合以上幾個方面可以大致判定建模是否成功。

七、小結(jié)

選用新西蘭大白兔建立脊柱結(jié)核模型已趨于成熟和規(guī)范，但是還存在著MTB培養(yǎng)與鑒定需時較長、術前致敏劑量模糊、MTB配制的最適濃度范圍較窄、建模成功率低、吸附MTB材料種類較少等問題。在以后對模型的研究過程中，可以選用生長更快的培養(yǎng)基，條件允許下可以增加飼養(yǎng)動物的數(shù)量，從更小梯度的濃度開始配制MTB，以探索出更精確的最適MTB菌量濃度。對于致敏劑量可以準確到體質(zhì)量與注射劑量之間的關系，以獲得更恰當?shù)拿庖叻磻?。在植入的吸附材料中，可以發(fā)現(xiàn)更多的不同種類的材料，并且對其進行細致的研究，從而找出對骨組織更加有親和力的材料。對今后的結(jié)核動物模型研究時，可在多個實驗條件成熟后，制定出規(guī)范化的術前準備、術中操作和術后鑒定等標準，以此提高脊柱結(jié)核動物建模的成功率。