李德芬，朱俊平

（1．山東省壽光市上口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)管理站，山東 壽光 262700；2．山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261061）

奶牛乳房炎又叫奶牛乳腺炎，是乳腺受到物理、化學(xué)、微生物學(xué)刺激所發(fā)生的一種炎性反應(yīng)。奶牛乳房炎不僅使奶牛產(chǎn)乳量下降，降低生鮮乳和乳制品的質(zhì)量，還由于在臨床治療過(guò)程中盲目使用抗菌藥，導(dǎo)致乳中藥物殘留升高，污染環(huán)境且危害人類健康［1，2］。及時(shí)而正確診斷乳房炎成為防治奶牛乳房炎的關(guān)鍵。

1 加州乳房炎檢測(cè)法／蘭州乳房炎檢測(cè)法

加州乳房炎檢測(cè)法／蘭州乳房炎檢測(cè)法（CMT／LMT）基本原理是用一種陰離子表面活性物質(zhì)—烷基或烴基硫酸鹽，破壞乳中的體細(xì)胞，釋放其中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與試劑結(jié)合產(chǎn)生沉淀或凝膠。乳中體細(xì)胞越多，產(chǎn)生的凝膠也就越多。該方法操作簡(jiǎn)單，易于掌握，在臨床中經(jīng)常使用，但結(jié)果受年齡、季節(jié)等多種因素的影響。

CMT法具體操作步驟是先將2 mL被檢乳置于塑料乳房炎檢驗(yàn)盤中，再加入2 mL CMT試劑（試劑配方：烷基硫酸鈉 30～50 g，苛性鈉 15 g，溴甲酚紫0．1 g，蒸餾水 1 000 mL），緩慢以同心圓狀攪拌 10 s。然后根據(jù)乳汁的顏色與狀態(tài)判定結(jié)果：乳汁無(wú)變化，不出現(xiàn)凝塊判為陰性（－）；乳汁出現(xiàn)微量沉淀，不久就又消失的傾向?yàn)榭梢桑ā溃?；乳汁部分形成凝膠狀為弱陽(yáng)性（＋）；乳汁全部呈凝膠狀，在回轉(zhuǎn)搖動(dòng)時(shí)，凝塊向中央集中，一旦停止搖動(dòng)，凝塊呈凹凸?fàn)罡接诿蟮诪殛?yáng)性（＋＋）；乳汁全部呈凝膠狀，回轉(zhuǎn)搖動(dòng)時(shí)凝塊向中央集中，停止搖動(dòng)時(shí)仍保持原狀，并固著于皿底為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）；乳汁變?yōu)辄S色意味著細(xì)菌增多，乳糖被分解，乳樣呈酸性；乳汁呈深紫色則乳樣呈堿性［3］。

2 乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)（SCC）法

每毫升牛奶中含有細(xì)胞的數(shù)目即為體細(xì)胞數(shù)（SCC）。在正常的生理狀況下，每毫升牛奶中有2萬(wàn)～20萬(wàn)個(gè)體細(xì)胞。當(dāng)奶牛的泌乳系統(tǒng)受到不同種類細(xì)菌的侵襲而發(fā)生感染及損傷時(shí)，通過(guò)機(jī)體的免疫機(jī)制，承擔(dān)排除感染與修復(fù)任務(wù)的白細(xì)胞就會(huì)在此集聚，該乳腺組織分泌的乳汁中體細(xì)胞數(shù)量隨即大幅度上升，這樣，就可通過(guò)對(duì)乳汁中SCC的變化來(lái)判斷是否是隱性乳房炎。大量試驗(yàn)表明，當(dāng)牛乳中體細(xì)胞數(shù)達(dá) 5×105個(gè) ／mL 時(shí)，即存在乳房炎隱患［4］。 但體細(xì)胞的數(shù)量受年齡和胎次、泌乳期、季節(jié)、機(jī)體應(yīng)激、個(gè)體特征以及擠奶操作等因素的影響。

目前，檢測(cè)牛乳中體細(xì)胞數(shù)的方法有多種，主要有體細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法、電子計(jì)數(shù)法、熒光電子細(xì)胞計(jì)數(shù)法等。

2.1 體細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法

該法檢測(cè)結(jié)果最為準(zhǔn)確，常作為其他方法的對(duì)照。一般認(rèn)為每毫升乳汁中細(xì)胞數(shù)超過(guò)50萬(wàn)定為乳房炎，有的則認(rèn)為超過(guò)25萬(wàn)即可定為乳房炎［5］。但是，中國(guó)農(nóng)科院中獸醫(yī)研究所根據(jù)試驗(yàn)提出在治療乳房炎判定療效時(shí)，每毫升乳汁中細(xì)胞數(shù)降至100萬(wàn)以下就可定為正常，國(guó)外也有類似的報(bào)道。

2.2 電子計(jì)數(shù)法

首先將乳細(xì)胞在試管中進(jìn)行染色，然后用0．65 μm的微孔濾器將染好色的乳汁濾過(guò)，使細(xì)胞集于濾器上。濾器油浸處理后進(jìn)行檢查。這種方法操作比較簡(jiǎn)單快捷，是一種較為先進(jìn)的方法。

2.3 熒光電子細(xì)胞計(jì)數(shù)法

首先將乳樣用緩沖液稀釋并與一種染色劑混合、涂片，然后置于有轉(zhuǎn)盤裝置的顯微鏡上，當(dāng)轉(zhuǎn)盤經(jīng)過(guò)物鏡時(shí)，即可將熒光細(xì)胞的數(shù)目自動(dòng)記錄下來(lái)。全部操作均為自動(dòng)化，迅速便捷，每小時(shí)可計(jì)數(shù)180個(gè)乳樣。

3 乳汁中細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定

取采集的奶樣5 mL置于滅菌離心管中，3 000 r／min離心10 min，棄去離心管中的上層液體，吸取0．1 mL沉淀物分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和綿羊血瓊脂平板，置37℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h。觀察菌落形態(tài)、生長(zhǎng)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢［6］。

將符合鏈球菌形態(tài)特征的菌株接種于改良愛(ài)德華培養(yǎng)基，將符合葡萄球菌形態(tài)特征的菌株接種于綿羊血瓊脂平板，將符合革蘭氏陰性桿菌形態(tài)的菌株接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和S－S瓊脂培養(yǎng)基，初步判定細(xì)菌種類，并純化培養(yǎng)，將純培養(yǎng)物保存于試管斜面培養(yǎng)基內(nèi)。根據(jù)初步鑒定結(jié)果對(duì)分離到的菌株有選擇地進(jìn)行生化試驗(yàn)，接下來(lái)通過(guò)致病性試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)得出細(xì)菌較敏感的藥物，供臨床治療參考。

細(xì)菌培養(yǎng)診斷法專屬性強(qiáng)，能準(zhǔn)確得出致病菌敏感的藥物，便于臨床使用，但細(xì)菌培養(yǎng)法需要較長(zhǎng)的時(shí)間。

4 乳汁pH檢測(cè)法

患乳房炎的牛乳汁pH呈堿性，pH隨著體細(xì)胞和炎性細(xì)胞數(shù)量的增加而變大，正常乳汁的 pH在6．4～6．6；乳中體細(xì)胞數(shù)在 20 萬(wàn)～50 萬(wàn)／mL 時(shí)，乳汁pH 在 6．6～6．8；乳中體細(xì)胞數(shù)在 50 萬(wàn)～500 萬(wàn)／mL時(shí)，乳汁 pH 在 6．8～7．2；乳中體細(xì)胞數(shù)大于 500 萬(wàn)／mL時(shí)，乳汁pH在7．2以上。因此，利用牛乳汁pH的變化，可以間接地診斷出奶牛乳房炎及其發(fā)病的程度［7］。

通常使用的方法有溴麝香草酚藍(lán)（BTB）法和乳房炎試紙法。利用BTB濾紙片可快速診斷，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)迅速，靈敏度較高，但當(dāng)牛乳被摻入堿性物質(zhì)后檢測(cè)效果不理想。

5 電導(dǎo)率值檢驗(yàn)法

電導(dǎo)率檢測(cè)法是依據(jù)機(jī)體血漿與乳的滲透壓相等，健康奶牛乳汁滲透壓大部分是由氯化鈉和乳糖形成。發(fā)生乳房炎時(shí)，血－乳屏障的滲透性改變，Na＋、Cl－進(jìn)入乳汁，使乳汁電導(dǎo)率上升，此方法能迅速、準(zhǔn)確的檢測(cè)乳房炎。國(guó)內(nèi)外的專家學(xué)者在這方面做了大量工作，推出了很多通過(guò)乳汁導(dǎo)電性增強(qiáng)的原理來(lái)檢測(cè)隱性乳房炎的儀器。新西蘭生產(chǎn)的AHI乳房炎監(jiān)測(cè)儀僅能顯示隱性、陽(yáng)性和可疑，但不能顯示炎癥的輕重程度。國(guó)內(nèi)在這方面做了很多工作，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)推出SX－I型乳腺炎診斷儀，隨之又推出CN乳腺炎診斷儀；西北農(nóng)林科技大學(xué)研制出 XND－A型乳腺炎診斷儀。

6 氫氧化鈉凝乳試驗(yàn)法

在乳樣中加入氫氧化鈉，觀察乳汁中是否有凝塊來(lái)判斷是否患有乳房炎。乳汁肉眼觀察無(wú)異常變化，不透明者為陰性；乳汁出現(xiàn)小顆粒狀物者為可疑；乳汁略微透明，有凝乳塊形成者為弱陽(yáng)性；乳汁呈水樣透明，有比較大的凝乳塊形成者，奶牛已患上隱性乳房炎；乳汁完全透明，全部呈凝乳塊狀，奶?；加须[性乳房炎的情況比較嚴(yán)重［8］。苛性鈉凝乳試驗(yàn)法操作簡(jiǎn)單，易于掌握，但試驗(yàn)結(jié)果無(wú)統(tǒng)一明確的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果易受主觀判斷影響。

7 PCR診斷技術(shù)

目前，PCR診斷已經(jīng)成熟運(yùn)用于許多疾病的診斷，在奶牛乳房炎的診斷方面也有深入研究。依據(jù)原核生物的rRNA分為 5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，并且位于同一操縱子上。rRNA基因在大多數(shù)原核生物中都具有多個(gè)拷貝，拷貝數(shù)目從1～14個(gè)不等。其中16S rRNA序列分析已成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法，約有2 500種16S rRNA全序列已被報(bào)道。根據(jù)16S rRNA、23S rRNA在不同種的細(xì)菌中拷貝數(shù)、長(zhǎng)度、堿基排列順序及含有的tRNA基因的數(shù)量和種類不同，可判斷致病菌的種群［2］?；具^(guò)程類似于傳統(tǒng)的PCR，包括乳樣的制備、擴(kuò)增、凝膠電泳。其中無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌特異性引物的設(shè)計(jì)就是基于編碼16S rRNA的DNA序列，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌是基于編碼23S rRNA的DNA序列。PCR檢測(cè)敏感性高，并可確診感染的菌株，減少了微生物學(xué)診斷的繁瑣步驟，省時(shí)省力，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，特異性強(qiáng)，是未來(lái)研究的方向之一。