湯加勇，趙 華

Western Blot(蛋白印跡法)是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術相結合的雜交技術,具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優(yōu)點,是檢測蛋白質(zhì)特性、表達與分布的一種最常用方法,主要在分子生物學、生物化學、免疫遺傳學等學科中時常用到。Western Blot是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色,并且通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況[1-2]。就分子生物學現(xiàn)狀來看,現(xiàn)代生物科學是生物科學與眾多學科之間相互交叉、滲透和相互促進的結果。如分子生物學已滲入到分子發(fā)育生物學、細胞生物學、遺傳學、病毒學、飼料學、營養(yǎng)學等學科。學科間的相互交叉是科學研究發(fā)展的必然趨勢,特別是隨著分子生物學的快速發(fā)展,其將帶動整個生物科學的全面發(fā)展。

Western Blot分析技術作為分子生物學中一項定性和半定量檢測蛋白的常用技術,其操作技術已經(jīng)很成熟[2-3],但是國內(nèi)很多實驗室 (特別是非專業(yè)分子生物學實驗室)由于分子生物學發(fā)展和起步晚、儀器設備條件限制、人員條件限制等因素,導致很難順利開展該分析技術。四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所主要從事豬、禽、草食動物和水生動物的營養(yǎng)需要、營養(yǎng)代謝與調(diào)控、飼料營養(yǎng)價值評定、飼料加工配制技術及交叉領域,如抗病營養(yǎng)、分子營養(yǎng)、營養(yǎng)與微生態(tài)學等的研究,其在分子生物學方面的研究相對薄弱。因此,本實驗專門通過反復實驗建立了一個適合本實驗室的細胞樣Western Blot分析技術,在此與廣大同行進行探討。

1 細胞蛋白樣品的制備

把培養(yǎng)好細胞的培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基去掉,用預冷的PBS緩沖液(pH＝7.2)洗滌細胞(按6孔培養(yǎng)板計,PBS添加量為2 mL/孔,其余培養(yǎng)板按比例添加),輕輕搖動10 s,然后棄去洗液。按以上操作再洗滌細胞一次,然后將細胞培養(yǎng)板置于冰上(后面的操作均在冰上進行),添加提前準備好的RIPA細胞裂解液[4-6](按6孔培養(yǎng)板計,裂解液添加量為每孔0.4 mL,其余培養(yǎng)板按比例添加),然后用槍頭反復吹吸裂解液,加快細胞的裂解。待細胞裂解完全后(約2 min左右),把裂解液全部移至1.5 mL離心管中,放置于冰上。為了實驗的準確性及足夠的蛋白樣品量,常常需要把2個(甚至更多)培養(yǎng)孔的裂解液移至一個離心管中。待同一批樣品全部處理完后,再統(tǒng)一于4℃、13 000 rpm離心5 min,將上清液體按一管60μL轉(zhuǎn)移到PCR管中,-80℃保存,最多可保存2個月(建議一個月內(nèi)做完)。

2 上樣蛋白樣品的制備

將保存的蛋白樣品拿一管用bicinchoninic acid(BCA)法測定總蛋白的濃度[7],為保證測定的準確性,同一樣品測定孔至少為6(n＝6),此處不能用考馬斯亮藍法測定總蛋白濃度[8-10]。根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)每孔上樣總蛋白量不低于30μg[4-6],計算每個樣本的加樣體積,所有樣本的體積用1×RIPA裂解液來調(diào)節(jié)一致(1.5 mL離心管中),再加入蛋白loading buffer,沒有樣品的孔也要用1×RIPA裂解液和loading buffer按照相同的比例添加,混勻后放入沸水或100℃金屬浴中10 min(一定注意不能讓離心管管蓋爆開),然后迅速放置于冰上10 min。待冷卻后4℃、13 000 rpm離心10 min,小心吸取上清于PCR管中放置于冰上,準備上樣、電泳。

3 SDS-PAGE電泳

凝膠的制備：根據(jù)目的蛋白的大小來選擇合適濃度的分離膠。目的蛋白小于20 kDa選擇12～15的分離膠；大于20 kDa選擇10的分離膠,濃縮膠一般固定為5[4-6]。Bio-Rad品牌的垂直凝膠電泳系統(tǒng)中,具體分離膠、濃縮膠的濃度及加樣體積如表1所示[11]。

電泳：待凝膠制備好后,取出凝膠放入電泳槽中,加入電極緩沖液,用加樣器緩慢加入相同體積的制備好的蛋白液 (1 mm厚玻板的每孔最大上樣量為30μL),加樣過程中一定要避免氣泡的產(chǎn)生,同時要在樣品旁加預染的蛋白分子量標準,沒有樣品的孔添加相同體積的1×RIPA裂解液和loading buffer混合液。加好樣品后,60 V電泳30 min,然后120 V電泳60 min或溴酚藍至玻板底部。

4 半干法轉(zhuǎn)膜

在SDS-PAGE電泳時,將PVDF膜裁剪好,放入倒有甲醇的120 mm玻璃培養(yǎng)皿中先活化15 s,然后迅速轉(zhuǎn)移至1×轉(zhuǎn)膜液中,同時放入Bio-Rad的轉(zhuǎn)印濾紙一起浸泡至少15 min。待電泳完畢后,取出凝膠在1×電轉(zhuǎn)膜液中浸泡至少15 min。然后按濾紙—PVDF膜—SDS—PAGE膠—濾紙的順序放置好 (濾紙、PVDF膜和凝膠的大小要一致),15 V條件下根據(jù)目的蛋白大小電泳40～50 min(40 kDa左右蛋白一般電泳45 min)。

5 Western Blotting

轉(zhuǎn)膜完畢后,根據(jù)預染蛋白分子量標準,用刀片切割目的蛋白條帶,放入孵育盒于5的BSA(5BSA用1×TBST溶解)、80 r/min進行封閉至少1 h(一般2 h)。根據(jù)一抗效價,按居中比例加入一抗孵育液 (用5的BSA稀釋),4℃孵育過夜。一抗的添加比例可根據(jù)目的蛋白的表達情況適當調(diào)整,如有磷酸化的蛋白則應先做。過夜后回收一抗孵育液 (一抗孵育液4℃放置可保存2周,至少可使用3次)[12],然后用1×TBST、80 r/min洗膜至少5 min,洗4次。根據(jù)二抗效價,按居中比例加入二抗孵育液 (用 5的BSA稀釋),80 r/min、室溫孵育1～2 h(一般2 h)。回收二抗孵育液 (二抗孵育液4℃放置可保存2周,至少可使用3次),然后用1×TBST、80 r/min洗膜至少5 min,洗4次。HRP化學發(fā)光液按A液 ∶B液＝1∶1的比例加好,把洗凈的PVDF膜用衛(wèi)生紙去掉多余的洗膜液后放入發(fā)光液體、室溫、避光孵育2～3 min后用衛(wèi)生紙去掉多余的發(fā)光液[3],然后放入化學發(fā)光成像儀 (Bio-Rad)成像,根據(jù)條帶亮度的強弱調(diào)整曝光時間和圖片張數(shù)；通過成像軟件Image Lab(Bio-Rad)對圖片進行相應的處理,計算出相應的蛋白表達量,即可對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析[1-3]。

6 膜的洗滌和再次Blotting

用1×TBST對曝光過后的PVDF膜進行洗滌(80 r/min至少5 min,至少洗4次)。洗完后加入stripping buffer、室溫、80 r/min放置至少2 h；然后用1×TBST對膜進行洗滌 (80 r/min至少5 min,洗4次),最后將膜放置于1×TBST中4℃保存,準備做下一次Blotting。

7 特別需要注意的問題

1)蛋白在反復凍融情況下極易降解,于是樣品裂解后一定要按照使用量對樣品進行分裝保存,每次使用時取一管或多管,溶解后切勿放回冰箱再次使用；

2)一抗的選擇特別重要,現(xiàn)在市面上進口抗體假貨較多,不管用國產(chǎn)或進口抗體如果使用多次后都做不出結果,那應該考慮更換其他公司的抗體；

3)封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液盡量不要為了節(jié)省經(jīng)費而使用脫脂奶粉,最好使用5的BSA；

4)PVDF膜一旦活化后就絕對不能讓其變干,否則會嚴重影響實驗效果[13]。

8 各種試劑配方

1)RIPA裂解液的配制。

1 mL的 1×RIPA裂解液中含有 10μL的Protease inhibitor、 10 μL的 Phosphatase inhibitor 3、10μL的Na3VO4(濃度為100μmol/L)、10μL的PMSF(濃度為10 mg/mL),冰上放置,現(xiàn)用現(xiàn)配。

2)SDS-PAGE膠的配制。

SDS-PAGE膠的配制試劑及用量如表1所示。

表1 SDS-PAGE膠配方表

3)電極緩沖液的配制。

10×電極緩沖液為Trizma base 30.3 g、Glycine 144.0 g、SDS 10.0 g加dd H2O定容到1 L；使用時取10×電極緩沖液100 mL加水900 mL混勻、4℃保存即可。

4)轉(zhuǎn)膜液的配制。

10×轉(zhuǎn)膜液為 Trizma base 30.3 g、Glycine 144.0 g加dd H2O定容到1 L；1×轉(zhuǎn)膜液為10×轉(zhuǎn)膜液100 mL加700 mL的dd H2O加200 mL的甲醇,4℃保存。

5)1×TBST的配制。

10×TBS為 Tizma HCl 31.52 g、 NaCl 87.7 g加500 mL的dd H2O溶解后,調(diào)pH到7.4,然后定容到1 L； 1×TBST為100 mL的10×TBS加899 mL的dd H2O加 1 mL的 Tween 20混勻、4℃保存即可。

6)Stripping buffer的配制。

9 結束語

針對本實驗室的具體情況,本文通過對細胞樣品Western Blot分析操作的每個步驟進行摸索,專門建立了一個適合本實驗室細胞樣Western Blot的分析技術規(guī)范。本操作步驟更注重細節(jié),比網(wǎng)上下載的普通步驟更詳細,讓WB分析更容易。本實驗結果 (操作步驟和試劑配方)能很好地應用于其他實驗室細胞樣品的WB分析。

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