劉湘花，張俊霞，孫麗敏，盧小康，李瑞琴

半薄切片(1μm)介于電鏡超薄切片(70 nm)和光鏡石蠟切片(4～8μm)之間,由于電鏡樣本小,為使電鏡能夠觀察到目標(biāo)結(jié)構(gòu),進(jìn)行超薄切片前必須做半薄切片進(jìn)行定位。半薄切片的制備方法和電鏡的制備方法一樣,經(jīng)固定、脫水、包埋成樹脂塊,在超薄切片機(jī)上用玻璃刀制取,再經(jīng)染色后,在光學(xué)顯微鏡下觀察。在制片的過程中容易出現(xiàn)染色不均勻、脫片、切片皺折重疊,影響觀察與目標(biāo)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位等問題。本實(shí)驗(yàn)室在半薄切片技術(shù)方面積累了一些經(jīng)驗(yàn),對(duì)染液、染色時(shí)間、防脫片和撈片工具方面進(jìn)行了改進(jìn),取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠海馬標(biāo)本,超薄切片機(jī) (EMUC-7),烘片機(jī) (KD-H),光學(xué)顯微鏡 (OLYMPUS CX31),甲苯胺藍(lán),硼砂。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)環(huán)氧樹脂812包埋

1.2.2 切片

包埋后的組織塊于萊卡超薄切片機(jī) (EMUC-7)上切片,切片厚度為1μm,將切片用牙簽轉(zhuǎn)移至載玻片上,至烘片機(jī)上70℃烤干。

1.2.3 染色

1)常規(guī)染色方法。

染液用0.1 mol/L磷酸緩沖液來稀釋甲苯胺藍(lán)(濃度1)。

2)改良染色方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

隨機(jī)選取5組切片,每組20張,使用傳統(tǒng)方法和改良方法進(jìn)行半薄切片,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (X±S)方式記錄各組切片的脫片率及皺褶率,應(yīng)用SSPS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包,采用one-way ANOVA方差分析,p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)改良的甲苯胺藍(lán)染色后,細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜界線清晰,層次分明。細(xì)胞核色深,細(xì)胞質(zhì)色淺 (如圖1所示)。對(duì)比傳統(tǒng)方法,改良方法出現(xiàn)的皺褶率與脫片率均較低 (p＜0.05,如圖2所示)。

圖1 傳統(tǒng)染色方法與改進(jìn)染色方法對(duì)比

3 討論

3.1 染液的改進(jìn)

半薄切片的常規(guī)染色方法有甲苯胺藍(lán)染色法、HE染色法等,這些染色方法染色前切片均需要進(jìn)行脫樹脂處理[2],以便染料滲入,染色均勻。但是脫樹脂操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且消耗試劑,若有樹脂殘留還會(huì)出現(xiàn)染色不均勻,同時(shí)也會(huì)影響到標(biāo)本的定位觀察[3-4]。本實(shí)驗(yàn)室改良了甲苯胺藍(lán)染色法[5-6],用硼砂水溶液作為緩沖液代替磷酸緩沖液,磷酸緩沖液呈弱堿性 (pH為7.2～7.4),而硼砂水溶液呈強(qiáng)堿性 (pH為9.3),用硼砂水溶液代替磷酸緩沖液,能大大提高組織細(xì)胞的著色力。

3.2 染色時(shí)間的把握

一般的染色時(shí)間是3～5 min,改良后染色時(shí)間為15 min,且染色的同時(shí)將切片放至烘片機(jī)上70℃加熱,一方面可以使染料著色更加穩(wěn)固,另一方面加熱可防止脫片。

3.3 防脫片技巧

為防脫片,通常的操作是在載玻片上涂一層小牛血清、聚賴氨酸或APES膠[7],有的則用明膠-硫酸鉻鉀作為半薄切片的粘貼劑[8]。而按照本文所述方法不需要涂抹任何試劑,只需將滴加染液后的載玻片放至70℃烘片機(jī)上烘烤,時(shí)間約15 min,另外流水沖洗切片時(shí),注意不能直接對(duì)著組織沖洗便可避免脫片,操作非常簡便。

3.4 撈片的改良

一般撈取切片常用的工具是毛筆、眉筆或者金屬環(huán)[9-12],但切片不易平展地漂浮于水滴表面,且容易導(dǎo)致切片出現(xiàn)重疊或皺折。本文建議撈片時(shí)可以用牙簽在水面順時(shí)針捻轉(zhuǎn)將切片卷起,然后再逆時(shí)針捻轉(zhuǎn)牙簽將切片再漂在載玻片的水滴上,方法簡便,且撈取的切片不會(huì)重疊,沒有損傷,也不會(huì)出現(xiàn)皺折。

4 結(jié)束語

本文所論述改進(jìn)后的半薄切片技術(shù)更適用于透射電子顯微鏡半薄超薄切片的準(zhǔn)確定位,是一種簡便易行、效果良好的方法,值得推廣。

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