馬冠英，趙起超，王 犇，陳麗潔，陳功星

蛋白印跡(western blot)是蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù),也是生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究最普通的基因表達(dá)研究工具。它結(jié)合了電泳分析容量大、分辨率高和免疫分析敏感性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1]。自從該技術(shù)建立以來(lái),數(shù)十年一直在生物學(xué)研究領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用[2]。據(jù)相關(guān)報(bào)道,通過(guò)對(duì)抗體進(jìn)行改進(jìn),降低傳統(tǒng)蛋白質(zhì)免疫印跡法的檢測(cè)靈敏度增高,重復(fù)性好,可用于生物樣本中痕量被檢測(cè)物的測(cè)定[3]。該技術(shù)的主要步驟是電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、顯影,操作過(guò)程比較繁瑣,時(shí)間和資金有一定的耗費(fèi),且存在著進(jìn)一步提升改進(jìn)的空間。本文通過(guò)減少PVDF膜大小,優(yōu)化了蛋白印跡技術(shù),同時(shí)對(duì)凝膠電泳玻璃板進(jìn)行了創(chuàng)造性的改進(jìn),使該技術(shù)更加精簡(jiǎn)實(shí)用[4]。

1 小膜轉(zhuǎn)移蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛋白提取、預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)物(marker)、電泳膠及相關(guān)試劑等均購(gòu)于試劑公司(碧云天生物技術(shù)有限公司),PVDF膜(Immuno-Blot PVDF Membrane),考馬斯亮藍(lán)染色液為實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)[5]自配,電泳和轉(zhuǎn)膜設(shè)備(bio-rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白電泳

1.2.2 切膠剪膜

把整個(gè)電泳長(zhǎng)短兩塊玻璃及其內(nèi)部凝膠,置于裝有一定量的轉(zhuǎn)膜緩沖液中,小心撬開(kāi)長(zhǎng)短玻璃,使凝膠一直貼于長(zhǎng)玻璃板上,滑動(dòng)短玻璃板,根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參的分子量,參照預(yù)染marker位置,以短玻璃板為界尺,用手術(shù)刀片切出含目的蛋白和內(nèi)參的凝膠帶,然后在轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡30 min。

1.2.3 轉(zhuǎn)膜

剪取比轉(zhuǎn)膜凝膠周邊大約2 mm的PVDF膜,用甲醇浸透后約30 s,在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15 min；再剪2張濾紙(其大小和PVDF膜一致,亦可略大),用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕后,備用。安裝轉(zhuǎn)膜夾 (膜在正極,膠在負(fù)極),在低溫恒流250 mA條件下,轉(zhuǎn)膜2 h。

1.2.4 染色與攝像

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,PVDF膜浸在染色液中染色1 min,然后將膜浸在脫色液置于搖床上,每1 h換一次液體,反復(fù)脫色,直到蛋白條帶清晰可見(jiàn)。然后在膜旁放置標(biāo)尺,進(jìn)行數(shù)碼相機(jī)攝像,結(jié)果通過(guò)圖形組合顯示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)中使用了兩塊膠和膜,分別對(duì)應(yīng)于完整的膠和沿著49 KD分子切割的膠,完整的膠從大分子到小分子全部轉(zhuǎn)移到大的膜上(如圖1(a)所示),在最大分子標(biāo)記117 KD以下,蛋白質(zhì)條帶明顯,全長(zhǎng)在7 cm范圍內(nèi),而小膜轉(zhuǎn)移蛋白在49 KD～19 KD之間,蛋白條帶也明顯,整個(gè)膜范圍在近3 cm內(nèi)(如圖1(b)所示),兩張膜的寬度接近,按照電泳玻璃槽的寬度,小膜的面積只有大膜的一半。蛋白印跡分析的轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn),一直有相關(guān)的研究,分子雜交是可以在凝膠上直接進(jìn)行的,相關(guān)的DNA分子凝膠生物素顯色和增色表明了凝膠上的便利[6],曾經(jīng)有商品化的專(zhuān)用凝膠供應(yīng),但是對(duì)于免疫結(jié)合分子的蛋白印跡實(shí)驗(yàn),存在兩個(gè)經(jīng)濟(jì)上的缺點(diǎn)。首先,該種凝膠價(jià)格昂貴,接近SDS-聚丙烯酰胺凝膠的10倍；其次,雜交過(guò)程中的抗體濃度達(dá)到了膜上雜交濃度的10倍左右,此外凝膠容易破碎,因此,轉(zhuǎn)膜仍然是目前不可缺少的技術(shù)手段。當(dāng)然,印跡膜除了PVDF膜外,還有醋酸纖維膜、尼龍膜,但后兩種膜在韌性、吸收蛋白、抗化學(xué)處理、保存等綜合性能方面不如前者,PVDF膜機(jī)械強(qiáng)度高,與蛋白具有較強(qiáng)的界面相互作用[7],無(wú)疑在多數(shù)實(shí)驗(yàn)中是最好的,但也是最昂貴的。所以,PVDF膜使用需要謹(jǐn)慎。轉(zhuǎn)膜常規(guī)做法是電泳結(jié)束后,根據(jù)凝膠的大小,剪裁同樣或者略大于凝膠周邊的膜。本方法先參照預(yù)染Marker分子量,根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白分子量范圍,以短玻璃片為界尺,用手術(shù)刀片切割。當(dāng)然塑料小鏟也能做到,只是沒(méi)有手術(shù)刀片切割整齊?？s小凝膠大小,然后剪裁PVDF膜,由于縮小了凝膠,所使用的小PVDF膜不到全膠膜的一半 (如圖1(b)所示),染色的結(jié)果相近。實(shí)際上,不管大膜、小膜,最后的結(jié)果都顯示在膜的很小范圍內(nèi),因?yàn)槟康牡鞍追肿釉谀z上分布的范圍很小。對(duì)于目的蛋白與內(nèi)參分子量相差較大的轉(zhuǎn)膜,可以參照本方法分別切出兩條小凝膠及相應(yīng)大小的PVDF膜。小PVDF膜除了節(jié)約膜的使用,在抗體雜交使用量上也要經(jīng)濟(jì)。PVDF膜適用于所有的蛋白質(zhì)、酶的N末端氨基酸序列分析及總氨基酸組成分析,效果十分理想[8]。本方法僅比常規(guī)方法多了一個(gè)裁膠步驟,對(duì)于需大量使用PVDF膜進(jìn)行蛋白印跡分析的生物醫(yī)學(xué)研究及缺乏western blot使用經(jīng)驗(yàn)的初始研究工作者和高校實(shí)驗(yàn)教學(xué),本方法值得借鑒。

圖1 蛋白轉(zhuǎn)移膜考馬斯亮藍(lán)染色

3 凝膠電泳刻度玻璃板設(shè)計(jì)

從上述實(shí)驗(yàn)可以看出,凝膠和膜大小參數(shù)模糊,是因?yàn)楝F(xiàn)有的凝膠電泳玻璃板上,沒(méi)有任何標(biāo)示,配制膠和電泳過(guò)程中,電泳相關(guān)技術(shù)參數(shù)(如分離膠的高度、電泳標(biāo)志物位置和決定凝膠大小等)、凝膠大小和PVDF膜的剪裁難以具體表述,而這些參數(shù)對(duì)電泳技術(shù)及后續(xù)的轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)操作產(chǎn)生一定的影響,通常是模糊地口口相傳,沒(méi)有具體的大小度量表示和記錄,也就限制了研究經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)的廣泛傳播,研究人員溝通方面缺乏客觀指標(biāo),教學(xué)過(guò)程不能明確表示,給研究、教學(xué)工作帶來(lái)不便。本文利用AutoCAD軟件進(jìn)行畫(huà)圖,對(duì)凝膠玻璃厚板進(jìn)行創(chuàng)造性的改進(jìn),并用photoshop處理完善,生成圖片資料 (如圖2所示)。在垂直凝膠電泳的長(zhǎng)玻璃板外面,設(shè)計(jì)了縱向刻度標(biāo)尺和橫向刻度標(biāo)尺。縱向刻度標(biāo)尺和橫向刻度標(biāo)尺正交,正交中心位于玻璃板的中心,縱向刻度標(biāo)尺3,位于玻璃板2非凝膠電泳的表面,從下到上蝕刻66個(gè)等距離的短線表示 (單位：mm),8個(gè)中線和表示單位 (cm) (由1～8阿拉伯?dāng)?shù)字表示,其中1后面標(biāo)示cm)的8個(gè)長(zhǎng)線,構(gòu)成總長(zhǎng)8.3 cm的標(biāo)尺,其中4 cm處未標(biāo)示,并位于玻璃板中心位置,上下兩邊分別標(biāo)出0.15 cm中的1條短線,刻度和數(shù)字均陰文反寫(xiě)于右邊?？潭葮?biāo)尺4與刻度標(biāo)尺3位于同一表面,從右到左依次標(biāo)示兩塊墊條玻璃之間的距離8.3 cm,其余情況與刻度標(biāo)尺3相同。縱向刻度標(biāo)尺和橫向刻度標(biāo)尺的刻度和符號(hào)均為反寫(xiě),以方便實(shí)際操作讀數(shù)。此設(shè)計(jì)讓使用者可以清楚地觀察和交流凝膠電泳過(guò)程中,電泳膠配制、電泳標(biāo)志物位置和后續(xù)實(shí)驗(yàn)涉及轉(zhuǎn)移膜等大小參數(shù),簡(jiǎn)單實(shí)用,此設(shè)計(jì)類(lèi)似于電泳梳的改進(jìn)[9],都是完善電泳技術(shù)而值得發(fā)展。該技術(shù)有待于進(jìn)一步地研發(fā),存在一定的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。

圖2 刻度玻璃板外側(cè)面

4 結(jié)束語(yǔ)

科學(xué)研究在社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中體現(xiàn)了重要的作用,但多數(shù)的科研直接效應(yīng)并不明顯,因此建設(shè)和投入不受重視,而科研直接關(guān)系著個(gè)人和部門(mén)的發(fā)展,因此實(shí)驗(yàn)室成了稀缺資源,條件越好越稀少,實(shí)驗(yàn)室資源非常有限[10]。實(shí)驗(yàn)室建設(shè)除了貴重儀器設(shè)備外,在很大程度上依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)和提高,尚可在現(xiàn)有條件下,進(jìn)行一定程度的改進(jìn),解決傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室面臨的設(shè)備老化及資源緊缺等問(wèn)題[11-12]。本文闡述了蛋白印跡分析技術(shù)中凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜交流表述方面的參數(shù)與改進(jìn),技術(shù)上難度不大,但在此之前,操作過(guò)程中存在一定的困難,在高校教學(xué)和科研工作中受到了影響,經(jīng)過(guò)查閱資料和實(shí)驗(yàn)研究,反復(fù)比較,總結(jié)成文以饗讀者,尤其是在原來(lái)基礎(chǔ)上對(duì)凝膠電泳玻璃板進(jìn)行創(chuàng)造性的改造,進(jìn)一步完善了蛋白印跡技術(shù),具有一定的知識(shí)產(chǎn)權(quán)研發(fā)和推廣價(jià)值。此外,本文對(duì)于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)革新和設(shè)備建設(shè),也具有一定的參考意義。

[1]王永強(qiáng),張敬禮.蛋白免疫印跡技術(shù)[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),1992,13(3)：101-105.

[2]TOWBIN H,STAEHELIN T,GORDON J.Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheet：procedure and some applications[J].Pnas,1979,76(9)：4350-4354.

[3]馮愛(ài)平,扎拉嘎胡,李威,等.高靈敏的蛋白質(zhì)免疫印跡新方法用于β-淀粉樣蛋白檢測(cè)[J].生物技術(shù)通訊,2014,25(2)：245-247.

[4]周毅,別平,孫占平,等.自制和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備是加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的重要途徑[J].高校實(shí)驗(yàn)室工作研究,2000(1)：44-45.

[5]李永明,趙玉琪.實(shí)用分子生物學(xué)方法手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,1998.

[6]黃承漢,胡惠廉,袁恬瑩.直接凝膠雜交法的生物素顯色與增色[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1986(6)：59-61.

[7]孔令泉,蒲瑩暉,馬仕坤,等.快慢轉(zhuǎn)法及不同濾膜和顯色檢測(cè)法在western blotting中的應(yīng)用分析[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(1)：26-29.

[8]陳麗蓉.PVDF膜在電印跡法中的應(yīng)用[J].生物技術(shù),1998,8(3)：45-46.

[9]韓丁丁.電泳梳的改進(jìn)[J].生命的化學(xué),2003,23(6)：473.

[10]陳功星,王世貴,俞誠(chéng),等.普通細(xì)胞培養(yǎng)室的建設(shè)與管理[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2011,30(11)：151-154.

[11]吳偉哲,韓秀玲.在線虛擬網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的改進(jìn)與完善[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2014,33(1)：13-16.

[12]周勇義,黃凱,張黎偉.加強(qiáng)統(tǒng)籌規(guī)劃建立大型儀器共享保障體系[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2010,27(9)：13-15.