鄭 翔，蘇 璐，馬玉瓊，畢文杰，李小京

當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)顯微制片工作中,石蠟和冷凍制片法占主導(dǎo)地位,一般分別用于永久切片制作和快速診斷[1]?；鹈弈z包埋制片法作為最早的制片手段,正在逐漸淡出教學(xué)和科研領(lǐng)域。我們認為,該法不受青睞的原因主要有以下3點：1)包埋、切片操作至少歷時約3周,而石蠟、冷凍法最快分別為2 d和1 h,故火棉膠法耗時最長；2)切片操作須使用滑行切片機,連續(xù)切片或批量制片難度較大[2]；3)火棉膠易被某些染色劑著染,需要控制背景染色。以本文作者所在的3所院校為例,除作者外,在職人員現(xiàn)已無人掌握本技術(shù)。近年發(fā)表的論文中也鮮見使用該法[3-5],且報道的技術(shù)流程仍顯陳舊。根據(jù)實踐,火棉膠法雖然耗時長,對經(jīng)驗要求較高,但在處理過硬或過軟的標(biāo)本、特大尺寸標(biāo)本(短徑超過3 cm)、特厚(超過50μm)切片等特殊場合,仍然無法被取代。本文將以腦特殊染色及甲狀腺常規(guī)制片為例,介紹火棉膠包埋制片法的原理、操作過程和技術(shù)經(jīng)驗,爭取使該方法在顯微制片應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮應(yīng)有的作用。

1 技術(shù)原理

火棉膠包埋制片法的主要步驟與石蠟包埋制片法[1]類似。標(biāo)本經(jīng)化學(xué)固定、脫水,然后被火棉膠包埋劑浸透,硬化后行顯微切片[2]?；鹈弈z(collodion)是 “硝化纖維素”(nitrocellulose,舊稱“硝化棉”或 “火棉”)的凝膠樣形態(tài),其溶液呈黏稠液體?；鹈弈z與水不相溶,包埋前也需嚴格脫水?；鹈弈z法與石蠟法也有顯著區(qū)別：1)火棉膠包埋硬化通過溶劑揮發(fā)實現(xiàn),(石蠟法則為冷凝),標(biāo)本不變形但耗時很長；2)火棉膠塊的硬度與揮發(fā)前溶液的濃度正相關(guān) (石蠟塊的硬度則與石蠟熔點正相關(guān)[1])；3)火棉膠塊的韌性和硬度大于石蠟塊,一般采用滑行切片機制片,失敗率很低；4)火棉膠切片須保存于70～90乙醇,且大多用漂片法染色,操作相對麻煩,但處理大尺寸切片更為靈活。

2 梯度火棉膠溶液的制備

我們近年來提高了標(biāo)本脫水效率[7]。新的脫水方法可移植用于火棉膠包埋標(biāo)本,火棉膠的溶劑換用四氫呋喃。絮狀硝化纖維素或充分干燥、回收的火棉膠塊可直接用四氫呋喃溶解、稀釋。四氫呋喃本身的揮發(fā)性很強,浸透和包埋操作的步驟與經(jīng)典方法相同。四氫呋喃流程配液更簡便,耗時約短,且標(biāo)本收縮、硬化程度更低。

3 標(biāo)本預(yù)處理的要求

火棉膠包埋制片對標(biāo)本的要求較低。厚度(最窄處的尺寸)在5 cm以下、硬度不太大 (如鈣化組織局部脫鈣不徹底),均可順利切片。固定液的要求也與石蠟法大致相同,但含高濃度苦味酸的固定液 (特別是Bouin配方[1])處理后,須用70乙醇充分洗脫,避免其妨礙火棉膠的凝固硬化。

表1 標(biāo)本脫水和火棉膠浸透流程(標(biāo)本厚度2 cm)

4 脫水、包埋流程

用于火棉膠包埋的標(biāo)本,固定后可按表1所示的流程行脫水與火棉膠浸透。表1依據(jù)2 cm厚標(biāo)本制定,尺寸過大時應(yīng)大幅增加各步的用時。火棉膠制片法的標(biāo)本,過度硬化一般不降低切片成功率。在浸入膠液后,各步時長分別增加1～2天,未見不利影響(70乙醇以后、浸入膠液前的各步,延時過長標(biāo)本將顯著收縮)。

圖1 火棉膠包埋塊及其底座

5 滑行切片操作

6 染色操作

火棉膠切片的染色流程也包括染色前處理、染色、脫水、封片4個環(huán)節(jié)[1]。其中,染色前從70乙醇起梯度下行入水,不需去除膠片。染色一般用漂片法。染色容器常用培養(yǎng)皿或多孔培養(yǎng)板。以腦切片Nissl染色為例,操作流程如表2所示,之后將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上,常規(guī)中性樹膠封片。封片時不能單用二甲苯,以免膠片收縮。我們通常采用叔丁醇完成最后的脫水,而封片樹膠用四氫呋喃溶解。大部分特殊染色 (如本文髓鞘染色[8])都可在本流程的基礎(chǔ)上稍加調(diào)整即可完成。

表2 貓腦火棉膠切片Nissl染色操作流程(片厚20μm)

表2 (續(xù)表)

常規(guī)HE染色參考表3的流程。HE染色時注意稍延長染色后水洗和乙醇脫水的時間,以褪去火棉膠片的紅色背景。

鍍銀染色標(biāo)本在包埋前已完成染色[6],可按表4的流程操作。封片時只滴樹膠,不加蓋玻片。

表3 火棉膠切片HE染色流程 (片厚10μm)

表4 鍍銀染色標(biāo)本的火棉膠切片處理流程 (片厚80μm)

7 制片結(jié)果和優(yōu)勢

火棉膠包埋制片法制作的染色切片,除常采用特制大尺寸玻片外,外觀上與石蠟法的成品無顯著差別。顯微鏡下觀察,特大尺寸標(biāo)本、硬度差別較大的標(biāo)本及厚切片等,結(jié)構(gòu)完整性、美觀性和立體層次感顯著優(yōu)于石蠟切片標(biāo)本。此處以腦和甲狀腺為例 (均采用Olympus C5060WZ數(shù)碼相機,顯微鏡為Olympus BX41,照相轉(zhuǎn)接筒為訂制)。

1)火棉膠法用于制作人和貓等腦標(biāo)本的斷面圖譜 (如圖3所示),斷面尺寸大而平整,常規(guī)石蠟制片法無法完成此項操作。

2)石蠟切片上甲狀腺濾泡有膠質(zhì)裂痕,火棉膠法無此人工假象 (如圖4所示)。

3)石蠟法致腦鍍銀染色標(biāo)本部分結(jié)構(gòu)褪色、神經(jīng)突起過早切斷,且難以制作超過30μm的優(yōu)質(zhì)切片?；鹈弈z切片上神經(jīng)突起的結(jié)構(gòu)清晰自然,染色均勻濃重,可制作厚片,鏡下立體層次感強(如圖5所示)。

圖3 腦染色結(jié)果

圖4 狗的甲狀腺HE染色比較

圖5 貓腦海馬CA2區(qū)冠狀面切片Golgi鍍銀染色比較

8 討論

本文介紹的火棉膠包埋制片法,既繼承了經(jīng)典技術(shù)方法,又融入了我們的經(jīng)驗和改進。其中,一些技術(shù)細節(jié)應(yīng)予重視。如配8火棉膠液時,勿在尚未充分溶解前加入乙醚,否則更難溶解。以前常用12的膠液包埋,但實踐表明,8的濃度已足夠,且節(jié)省兩步約6天。市售5火棉膠作包埋劑時,切片在乙醇中保存更易產(chǎn)生褶皺,不宜久置。包埋模具的內(nèi)表面須光滑、易與膠塊分離。老書中均記載自制折疊紙盒的方法。但對大尺寸標(biāo)本,紙盒不實用。一次性飲水紙杯是很好的選擇,不變形、不滲漏,包埋后杯壁與膠塊也完全不粘連。包埋期間揮發(fā)不可過快,否則膠塊內(nèi)部未凝固,經(jīng)70乙醇硬化定型后,內(nèi)外質(zhì)地不一,切片質(zhì)量低。修塊回收的膠應(yīng)先在干燥箱中完全干燥,再重新配置成8溶液。銀染標(biāo)本的膠塊因易變黑而不再回收?；鹈弈z切片脫水、透明的最后步驟不能采用無水乙醇和二甲苯。無水乙醇要溶解膠片,造成結(jié)構(gòu)離散,而二甲苯會使膠片嚴重收縮。我們在95乙醇之后,過渡到叔丁醇中完成徹底脫水,切片不溶解、不收縮。相應(yīng)地,把樹膠的溶劑換成四氫呋喃(叔丁醇揮發(fā)干燥過慢),封片效果良好。

滑行切片機是火棉膠制片的關(guān)鍵設(shè)備。由于設(shè)備構(gòu)造和操作的原因,滑行切片的速度比輪轉(zhuǎn)式切片慢,且要獲取厚度精確的連續(xù)切片難度較大。但是,滑行切片對標(biāo)本的軟硬程度和尺寸的要求很寬松,即使標(biāo)本脫水不良也極少遭遇切片失敗。因此,滑行切片機在特殊標(biāo)本的火棉膠切片、石蠟切片和冷凍切片[9]場合都有用武之地?；星衅瑱C的構(gòu)造幾十年來改變極小,當(dāng)前市售新機型可安裝一次性刀片,不需磨刀。

火棉膠切片極少用于組織化學(xué)實驗。主要原因是連續(xù)制片難,切片厚度較大,大分子標(biāo)記物滲透慢。有報道用輪轉(zhuǎn)式切片機切火棉膠塊[10],可解決切連片和薄片的問題 (此法無處理大尺寸標(biāo)本和厚切片的優(yōu)勢)。此外,火棉膠受熱易變形,檢測項目受限。但火棉膠包埋介質(zhì)及其操作本身并不影響這些檢測反應(yīng),曾有用火棉膠切片做分子檢測[11]的報道。

9 結(jié)束語

火棉膠包埋制片技術(shù)歷史久遠,至今仍不能被完全取代。如需處理尺寸特別大、硬度很高或很低的標(biāo)本,或者要求切片既要厚度尺寸大,又要結(jié)構(gòu)精細[12],應(yīng)考慮使用本方法。本法還在腦定位圖譜繪制、標(biāo)本三維重建、胚胎整裝片制作和神經(jīng)束路追蹤等工作中發(fā)揮重要作用。在更好的技術(shù)手段發(fā)展成熟之前,我們不應(yīng)忽視和忘記火棉膠包埋制片法。

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