蔣金芳，任 艷，梁偉華，龐麗娟

隨著分子生物學技術的廣泛應用，腫瘤的分子檢測與臨床靶向用藥為患者提供新的治療。目前，肺癌已進入精準治療時代，方案及藥物的選擇是根據其組織學亞型和分子學檢測結果共同制定[1]。近年以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)為靶點的分子靶向治療已成為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的治療方案，然而只有約1/3的患者存在EGFR敏感突變位點，對EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)的Gefitinib和Erlotinib藥物敏感。因此，獲得足量優(yōu)質的樣本進行基因檢測是指導靶向用藥的必要前提。

相對于手術和穿刺標本，獲取肺癌晚期患者的胸水標本具有便捷、創(chuàng)傷小、多次取材等優(yōu)勢，針對胸水標本是否用于基因檢測需依賴樣本中腫瘤細胞的絕對數(shù)、腫瘤細胞所占比率、腫瘤細胞保存程度及采用分子檢測方法的敏感性[2-4]。目前，大部分檢測機構取胸水離心細胞或細胞蠟塊切蠟膜提取核酸進行基因檢測，并未對檢測樣本中腫瘤細胞的絕對數(shù)和腫瘤細胞所占比率進行評估，基因檢測結果是否能真實反映腫瘤細胞的基因狀態(tài)值得進一步分析。本實驗在胸水細胞蠟塊中應用三種方法獲取腫瘤細胞進行基因檢測，對腫瘤細胞的絕對數(shù)和腫瘤細胞所占比率做進一步探討。

1 材料與方法

1.1材料收集石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科2014～2015年肺來源的惡性腫瘤胸水細胞蠟塊制成切片，請兩位高年資的病理醫(yī)師對標本HE、免疫組化閱片，挑選肺腫瘤細胞標本30例，參照《肺癌小標本取材相關問題的中國專家共識》，病理醫(yī)師對需要做基因檢測的胸水細胞蠟塊中腫瘤細胞數(shù)量及百分比進行評估。

1.2細胞蠟塊取1份胸水沉淀樣本約250 mL入50 mL離心管中，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，將收集沉淀物，用擦鏡紙包好放入包埋盒中，放入10%中性福爾馬林中固定1～2 h，按小組織常規(guī)標本處理[5]。

1.3三種方法獲取腫瘤細胞第一種常規(guī)方法：細胞蠟塊5 μm厚，連續(xù)切片5～10張蠟膜，收集到1.5 mL的EP管中。第二種激光顯微切割法：細胞蠟塊8 μm厚連續(xù)切片5～10張，自然晾干，HE染色，無水乙醇2 min，自然晾干，激光顯微切割儀(德國/AXT2022 ZEISS)選取并收集腫瘤細胞到收集蓋上(圖1)，腫瘤細胞數(shù)量大于200個[4],每例需3～4個收集蓋，將收集蓋中的腫瘤細胞經蛋白酶K(20 mg/mL)消化12 h，收集在1.5 mL EP管中。第三種刀片刮取法：細胞蠟塊5 μm厚，連續(xù)切片5～10張，完成烤片，HE染色，在低倍鏡下觀察，結合免疫組化用記號筆在腫瘤細胞區(qū)域劃圈，消毒刀片刮去非腫瘤細胞區(qū)域，用75%乙醇把這些區(qū)域擦干凈，更換刀片刮下的腫瘤細胞，估算腫瘤細胞數(shù)量大于200個，收集到1.5 mL的EP管中。

ABC圖1 用激光顯微切割法從胸水細胞蠟塊中獲取腫瘤細胞:A.切割前肺腺癌胸水細胞塊切片;B.切割后肺腺癌胸水細胞塊切片;C.收集蓋上的肺腺癌細胞

1.4DNA提取Qiagen法石蠟組織提取DNA步驟詳見說明書，提取好的DNA用核酸蛋白測定儀(Thermo scientific ND 2000)測定DNA質量及濃度，調整DNA濃度為2 ng/μL備用。

1.5EGFR基因檢測使用廈門艾德醫(yī)藥公司提供試劑(人類EGFR基因突變21種檢測試劑盒)的8聯(lián)管加入樣本DNA，使用實時定量PCR儀(美國/ABI 7500 Fast)檢測EGFR基因。

1.6統(tǒng)計學分析EGFR基因檢測所得數(shù)據，應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學處理，各組間率比較應用χ2檢驗。以P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1胸水細胞蠟塊中獲取腫瘤細胞進行基因檢測成功率比較30例胸水細胞蠟塊用三種方法獲取腫瘤細胞進行基因檢測成功率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.912，P=0.019)，常規(guī)切蠟膜法優(yōu)于刀片刮取法(χ2=6.667，P=0.024)，有6例細胞蠟塊切片上腫瘤細胞和間皮細胞、淋巴細胞混雜，用刀片無法刮取；而常規(guī)切蠟膜法與激光顯微切割法、激光顯微切割法與刀片刮取法基因檢測成功率，差異均無明顯統(tǒng)計學意義(χ2=4.286，0.480，P>0.05，表1)。

表1 胸水細胞蠟塊中獲取腫瘤細胞進行基因檢測成功率比較(n=30)

△常規(guī)切蠟膜法與激光顯微切割法相比，△△常規(guī)切蠟膜法與激光顯微切割法相比，△△△激光顯微切割法與刀片刮取法相比

2.2胸水細胞蠟塊進行分類將血性胸水、腫瘤細胞大于30%的胸水、腫瘤細胞大于10%且小于30%的胸水標本、腫瘤細胞大于1%且小于10%的胸水標本、腫瘤細胞小于1%的胸水五組標本進行檢測，其中前兩組用三種方法獲取腫瘤細胞EGFR檢測成功率一致；腫瘤細胞大于10%且小于30%的胸水標本用刀片刮取法有1例未成功；腫瘤細胞大于1%且小于10%胸水標本用激光切割法和刀片刮取法均有2例未成功；小于1%的胸水標本組3例，用激光切割法僅1例成功。刀片刮取法均未成功(即腫瘤細胞小于10%胸水標本兩組9例，用激光切割法和刀片刮取法只有5例和4例成功，表2)

表2 胸水細胞蠟塊進行分類[n(%)]

Ⅰ：血性胸水；Ⅱ：腫瘤細胞大于30%的胸水；Ⅲ：腫瘤細胞大于10%且小于30%的胸水標本；Ⅳ：腫瘤細胞大于1%且小于10%的胸水標本；Ⅴ：腫瘤細胞小于1%的胸水標本

2.3三種方法獲取胸水細胞蠟塊中腫瘤細胞EGFR基因檢測血性胸水、腫瘤細胞大于30%的胸水細胞蠟塊組和大于10%且小于30%的細胞蠟塊組，應用三種方法獲取腫瘤細胞進行EGFR檢測分別有2、2和3例陽性；但腫瘤細胞大于1%且小于10%的胸水細胞蠟塊組使用常規(guī)切蠟膜法、激光顯微切割法、刀片刮取法，EGFR基因檢測陽性例數(shù)分別為1/6、2/4、2/4(表3，圖2)；腫瘤細胞小于1%的胸水細胞蠟塊組，三種方法均未檢測出EGFR陽性。

圖2 三種方法獲取腫瘤細胞進行EGFR基因檢測陽性率比較

組織分類常規(guī)切蠟膜法陽性陰性激光顯微切割法陽性陰性刀片刮取法陽性陰性Ⅰ2(8)62(8)62(8)6Ⅱ2(6)42(6)42(6)4Ⅲ3(7)43(7)43(6)3Ⅳ1(6)52(4)22(4)2Ⅴ0(3)30(1)10(0)0合計8(30)229(26)179(24)15

Ⅰ：血性胸水；Ⅱ：腫瘤細胞大于30%的胸水；Ⅲ：腫瘤細胞大于10%且小于30%的胸水標本；Ⅳ：腫瘤細胞大于1%且小于10%的胸水標本；Ⅴ：腫瘤細胞小于1%的胸水標本

3 討論

隨著胸水細胞蠟塊技術的不斷完善，胸水標本在肺癌EGFR基因檢測中發(fā)揮越來越重要的作用，與手術標本和穿刺標本在病理診斷及基因檢測等方面相比，具有創(chuàng)傷小、可以實時檢測患者是否出現(xiàn)耐藥基因或者查找其他藥物敏感基因均無法替代的優(yōu)勢。

胸腹水脫落細胞檢查是細胞病理學診斷的有效手段之一，但常規(guī)胸腹水涂片上腫瘤細胞量少，無法精確提供組織學來源，且不適用于免疫組化鑒別診斷。細胞蠟塊技術不僅能夠富集腫瘤細胞且多次取材，同時HE細胞無皺縮和變性，染色鮮艷，免疫組化標記染色理想，細胞蠟塊可長期保存并反復切片，進行后續(xù)各種檢測，大大提高細胞病理學診斷的敏感性和特異性[6]。

研究證實：EGFR體細胞突變對Gefitinib 和Erlotinib 藥物治療后的潛在臨床反應起決定作用，EGFR-TKI結構域的前4個外顯子(18～21)其中18、19、21外顯子突變的患者對這兩種藥物的反應性更好[7-8]，而20外顯子突變使腫瘤細胞對EGFR-TKI產生抵抗，該突變主要見于EGFR-TKI治療后復發(fā)者。2017年NCCN指南建議，對于EGFR-TKI治療進展期的NSCLC患者在二線治療前，推薦進行二次活檢以明確EGFR-TKI耐藥機制。因此臨床醫(yī)師針對進展期的肺癌患者更傾向于抽取胸水進行基因檢測，以選擇更有效的治療方案。

胸水標本制成細胞蠟塊行HE、免疫組化染色確診為 NSCLC后，常規(guī)使用切蠟膜提取核酸進行EGFR基因檢測。文獻報道有高達12%的胸水標本出現(xiàn)間皮細胞與癌細胞難以鑒別并同時存在的狀況[9]，本實驗證實：胸水細胞蠟塊通過免疫組化抗體CK5/6和(或)CK7、TTF-1、Napsin A 表達以及WT1、Calretinin不表達，可明顯區(qū)分腫瘤細胞和間皮細胞，并確定腫瘤細胞百分比。

本實驗收集30例胸水標本中29例為肺腺癌，1例為腺鱗癌，有22例間皮細胞和腫瘤細胞并存的病例，8例血性胸水標本。參考《肺癌小標本取材相關問題的中國專家共識》及相關文獻[10]將肺癌胸水標本分成血性胸水、腫瘤細胞大于30%的胸水、腫瘤細胞大于10%且小于30%的胸水標本、腫瘤細胞大于1%且小于10%的胸水標本、腫瘤細胞小于1%的胸水五組標本，用三種方法獲取腫瘤細胞進行基因檢測，其中在血性胸水、腫瘤細胞大于30%和大于10%且小于30%三組中，檢測2、2和3例EGFR陽性；在腫瘤細胞小于1%的3例胸水標本中用刀片刮取法無法獲取腫瘤細胞，激光顯微切割法僅1例成功獲取腫瘤細胞，用常規(guī)切蠟膜法3例成功，但均未檢測出EGFR陽性；在腫瘤細胞大于1%且小于10%胸水標本有6例，使用激光顯微切割法和刀片刮取法成功4例，進行基因檢測均檢測出2例EGFR陽性，核對患者信息，其中1例用三種方法獲取腫瘤細胞基因檢測陽性患者信息一致，另1例EGFR陽性的患者用激光顯微切割法和刀片刮取法成功檢測，而使用常規(guī)切蠟膜法未檢測出EGFR陽性，由此推斷在腫瘤細胞所含百分比小于10%的樣本中用常規(guī)切蠟膜的方法，至少有1例未檢測出EGFR陽性。

三種方法獲取腫瘤細胞中，常規(guī)切蠟膜法適用于所有樣本，而對于間皮細胞和腫瘤細胞混雜且腫瘤細胞含量小于1%的樣本刀片刮取法無法完成；激光顯微切割法也適用于所有樣本，選用細胞數(shù)在200個以上，有4例由于提取核酸的量小于1 ng/μL未能成功檢測，可能由于激光切割后，收集蓋上的腫瘤細胞未能完全消化，核酸提取時損耗等方面原因，需要在后續(xù)的研究中針對收集蓋上的腫瘤細胞消化時間、消化液濃度及核酸提取等流程進一步優(yōu)化。

三種獲取腫瘤細胞方法中以常規(guī)切蠟膜法最為簡單，刀片刮取法次之，激光顯微切割法操作步驟最為復雜，成本最高。對血性胸水、腫瘤細胞大于10%(包含大于30%和大于10%且小于30%胸水細胞蠟塊)常規(guī)切蠟膜提取核酸比較方便；對成巢或成團的胸水細胞蠟塊用刀片刮取法比較實用，在腫瘤細胞和間皮細胞混雜并且間皮細胞豐富、腫瘤細胞百分比小于1%胸水標本中激光顯微切割法能獲取散在、單個腫瘤細胞，比刀片刮取法更具有明顯優(yōu)勢。

本實驗進一步證實大于200個腫瘤細胞可用于EGFR基因檢測，同時對血性胸水和腫瘤細胞大于10%的胸水細胞蠟塊推薦使用切蠟膜法，刀片刮取法更加精確獲取腫瘤細胞比較實用。對于腫瘤細胞小于10%的胸水細胞蠟塊可以依據其特點選擇刀片刮取法或激光顯微切割法，本實驗中基因檢測成功率以及獲取腫瘤細胞準確性方面推薦使用激光顯微切割法。基因檢測可以依據細胞蠟塊以及組織標本特點，結合實驗室條件選擇獲取腫瘤細胞最合適的方式，為臨床精確治療提供參考。

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