顧漪，趙育梅，蘇玉金

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是年輕人群死亡和致殘的主要原因之一[1]。創(chuàng)傷性腦損傷引起的功能缺損可由原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷導(dǎo)致。原發(fā)性損傷主要來自直接的生物機(jī)械外力；繼發(fā)性損傷則持續(xù)發(fā)展數(shù)小時(shí)到數(shù)天，并且是復(fù)雜的病理生理學(xué)事件的結(jié)果，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[2]。這些病理生理學(xué)事件包括線粒體功能障礙、離子穩(wěn)態(tài)失衡和腦水腫。線粒體功能障礙會(huì)引起氧化磷酸化減少和三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平下降[3]。ATP的逐漸下降干擾了離子泵的活性，如鈉鉀ATP酶。TBI后鈉鉀ATP酶活性下降導(dǎo)致細(xì)胞體積和滲透性失調(diào)，并引起細(xì)胞毒性腦水腫，使星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元腫脹[4]。對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后有效的治療可能需要考慮多個(gè)病理生理學(xué)事件的影響。

門冬氨酸鉀（potassium aspartate，PA）作為一種電解質(zhì)補(bǔ)充劑，在臨床上廣泛使用。鉀是細(xì)胞內(nèi)的一種重要的陽離子，參與大量酶促反應(yīng)。門冬氨酸是體內(nèi)草酰乙酸的前體，在三羧酸循環(huán)中起重要作用，并參與ATP的生成。門冬氨酸對(duì)細(xì)胞有很強(qiáng)的親和力，能增加鉀離子內(nèi)流[5]。過度的鉀離子外流和細(xì)胞內(nèi)鉀離子缺失是凋亡的早期關(guān)鍵性步驟。前期研究發(fā)現(xiàn)PA在腦缺血/再灌注大鼠中對(duì)細(xì)胞凋亡有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。盡管缺血性卒中和TBI源自完全不同的原發(fā)性損害，但其參與損傷過程的機(jī)制有許多相似之處[7]，其中之一便是腦血流量減少，導(dǎo)致微血管循環(huán)障礙和組織的氧糖剝奪。因此，本研究想了解PA是否能通過增加ATP水平，提高鈉鉀ATP酶活性和降低腦水腫，改善腦血流量，對(duì)TBI具有神經(jīng)保護(hù)作用。有許多模型可用于創(chuàng)傷性腦損傷研究，本實(shí)驗(yàn)選擇了可控性皮質(zhì)打擊傷（controlled cortical impact，CCI）作為創(chuàng)傷性腦損傷模型來研究。與其他模型相比，CCI模型有許多優(yōu)勢(shì)，如更加準(zhǔn)確，易于控制，并且更為重要的是，其誘導(dǎo)的TBI與人類的腦損傷相似[8]。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組 本研究經(jīng)北京市神經(jīng)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均按照研究用動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)報(bào)告（Animals in Research: Reporting In Vivo Experiments，ARRIVE）指南執(zhí)行[9]。研究采用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重300～330 g[3月齡，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2013-0001]；PA：原料藥，每瓶5 g（批號(hào)100602，遼寧藥聯(lián)制藥有限公司提供）。

將大鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，模型組大鼠造模全部成功，無死亡：①假手術(shù)組：給予生理鹽水（批號(hào)1508406，國藥集團(tuán)容生制藥有限公司），1 ml/kg；②溶劑對(duì)照組：生理鹽水，1 ml/kg；③門冬氨酸鉀組：62.5 mg/kg劑量的PA，在CCI造模后30 min腹腔注射給予各組藥物。

1.2 制模方法 采用顱腦打擊器制備大鼠CCI模型[10]。大鼠以400 mg/kg劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛麻醉，俯臥位放置在37℃恒溫板上。頭皮以正中線切開，去除骨膜，充分暴露顱骨，以前囟后2 mm，旁開2.5 mm為圓點(diǎn)，開一直徑為2.5 mm骨窗，保持硬腦膜完整。將大鼠固定在腦立體定位儀上（#68508，深圳瑞沃德生命科學(xué)有限公司），調(diào)整PinPointTM顱腦打擊器（PCI3000，美國Hatteras公司），將撞擊桿的頭端與硬膜接觸，設(shè)定打擊條件：打擊速度2 m/s，打擊深度2.5 mm，撞擊桿直徑4 mm，持續(xù)時(shí)間85 ms。打擊完成后，從立體定位儀上取下大鼠，填回顱骨并縫合頭皮。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腦血流灌注量監(jiān)測 以大鼠前囟后1 mm，右側(cè)旁開2.5 mm處為圓點(diǎn)，開一直徑4 mm的骨窗，保持硬腦膜完整，于CCI打擊前，打擊后即刻，打擊后30、60、90和120 min，采用激光微循環(huán)血流監(jiān)測動(dòng)態(tài)視頻系統(tǒng)（Pericam PSI HR，瑞典Perimed AB）對(duì)三組大鼠分別進(jìn)行腦血流灌注量監(jiān)測，每次監(jiān)測記錄1 min，計(jì)算1 min內(nèi)的平均腦灌注量。

1.3.2 神經(jīng)功能行為評(píng)分 在CCI打擊前和打擊后4、24、72 h，采用Chen等[11]的改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分表（modified Neurological Severity Score，mNSS）對(duì)三組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能行為評(píng)分，該評(píng)分包括一些特定反射的存在以及完成運(yùn)動(dòng)和行為學(xué)任務(wù)，如木板行走試驗(yàn)，木板平衡試驗(yàn)和自主運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)，總分為18分。該評(píng)分由一位分組盲法的實(shí)驗(yàn)者完成。

1.3.3 皮質(zhì)損傷體積的測量 皮質(zhì)損傷體積采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法描記后測量。在CCI后72 h，各組大鼠以水合氯醛麻醉后，經(jīng)心灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，組織脫水、石蠟包埋后，從前囟前1.2 mm到前囟后4.8 mm進(jìn)行冠狀切片，切片厚度5 μm，間隔500 μm[12]，每個(gè)標(biāo)本共獲得12張切片，進(jìn)行HE染色。所有切片用正置顯微鏡照相（DM4000B LED，德國萊卡），采用Image J軟件（NIH，1.48v）進(jìn)行分析，計(jì)算皮質(zhì)損傷體積，假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行皮質(zhì)損傷體積測量。

1.3.4 腦組織水含量測定 采用腦水含量測定法來評(píng)價(jià)腦水腫情況。用干濕稱重法測量損傷同側(cè)半球的水含量[13]，方法如下：大鼠在CCI后24 h以水合氯醛麻醉后處死，取出損傷側(cè)半球組織，稱重，該數(shù)據(jù)為組織濕重，然后在120℃烤箱內(nèi)放置24 h?？靖珊罄鋮s的組織再次稱重，所得數(shù)據(jù)為組織干重。組織水含量的計(jì)算公式為：（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.5 腦組織ATP、乳酸含量和鈉鉀ATP酶活性測定 CCI打擊后24 h，大鼠麻醉并處死，損傷側(cè)半球被取出，加入勻漿緩沖液（0.01 mol/L三羥甲基氨基甲烷，0.0001 mol/L乙二胺四乙酸，0.01 mol/L蔗糖，0.9%氯化鈉，pH=7.4）用于制備10%組織勻漿液。勻漿液在以3500 r/min于4℃離心10 min，收集上清液，用相應(yīng)的試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定ATP，乳酸含量和鈉鉀ATP酶的活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 神經(jīng)功能行為評(píng)分結(jié)果以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，其他數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用SPSS 19.0軟件，神經(jīng)功能行為評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)用非參數(shù)Kruskal-Wallis分析，腦血流灌注量結(jié)果采用重復(fù)測量方差分析和LSD檢驗(yàn)，其余各組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析以及LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 門冬氨酸鉀改善大鼠CCI后腦組織血流灌注量 大鼠CCI打擊前，打擊后即刻，打擊后30、60、90和120 min的腦血流灌注量結(jié)果見表1。重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，不同測量時(shí)間的腦血流灌注量差異有顯著性（P=0.001），不同測量時(shí)間和不同分組間無交互作用（P=0.145），三組之間測量結(jié)果比較，差異有顯著性（P＜0.001）。

2.2 門冬氨酸鉀改善大鼠CCI后的神經(jīng)功能評(píng)分 大鼠CCI打擊前，打擊后4、24和72 h的神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果見表2。假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)為正常的神經(jīng)功能評(píng)分，三組大鼠打擊后的神經(jīng)功能評(píng)分存在顯著性差異（KW=80.34，P＜0.001）。與假手術(shù)組相比，溶劑對(duì)照組大鼠在打擊后4、24和72 h的評(píng)分明顯升高（D=-63.75，P＜0.001；D=-57.05，P＜0.001；D=-55.40，P＜0.001），門冬氨酸鉀組大鼠打擊后4 h的神經(jīng)功能評(píng)分也明顯升高（D=-39.10，P＜0.05）；與溶劑對(duì)照組相比，打擊后24和72 h門冬氨酸鉀組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯改善（D=37.95，P＜0.05；D=39.65，P＜0.05）。

表1 門冬氨酸鉀對(duì)大鼠CCI后腦血流灌注量的影響

表2 門冬氨酸鉀對(duì)大鼠CCI后神經(jīng)功能評(píng)分的影響

圖1 門冬氨酸鉀對(duì)大鼠CCI后皮質(zhì)損傷體積的影響

表3 門冬氨酸鉀對(duì)大鼠CCI后腦水含量、ATP和乳酸水平及鈉鉀ATP酶活性的影響

2.3 門冬氨酸鉀降低大鼠CCI后腦皮質(zhì)損傷體積 CCI打擊后72 h，溶劑對(duì)照組和門冬氨酸鉀組大鼠的HE染色結(jié)果和皮質(zhì)損傷體積見圖1，兩組大鼠的平均損傷體積分別為（34.8±4.98）mm3和（17.3±1.23）mm3（圖1A），門冬氨酸鉀治療后能顯著降低大鼠的皮質(zhì)損傷體積（t=3.419，P=0.007）。

2.4 門冬氨酸鉀減輕大鼠CCI后腦水腫，增加腦ATP，降低乳酸水平并增加鈉鉀ATP活性 大鼠腦水含量測定結(jié)果顯示，CCI打擊后溶劑對(duì)照組和門冬氨酸鉀組的腦水含量明顯增加（F=7.928，P=0.002）；與溶劑對(duì)照組相比，62.5 mg/kg劑量的門冬氨酸鉀治療顯著減少腦水含量（q=2.622，P＜0.05）。

三組大鼠腦組織ATP含量，乳酸水平和鈉鉀ATP酶活性之間差異有顯著性（F=14.42，P＜0.001；F=3.628，P=0.040；F=13.11，P＜0.001）；與溶劑對(duì)照組比較，門冬氨酸鉀處理后能顯著提高腦組織的ATP含量，降低乳酸水平并增加鈉鉀ATP酶活性（q=4.544，P＜0.01；q=3.513，P＜0.05；q=3.409，P＜0.05）（表3）。

3 討論

門冬氨酸鉀的保護(hù)作用可能與鉀離子和門冬氨酸有關(guān)。以往的研究證實(shí)TBI可以引起鉀離子傳導(dǎo)的喪失，導(dǎo)致鉀離子穩(wěn)態(tài)失衡，最終促使神經(jīng)功能異常[14-15]。Filippidis等[16]發(fā)現(xiàn)了創(chuàng)傷引起的顯著的鈉離子下降和細(xì)胞外鉀離子升高，而鉀離子外流會(huì)導(dǎo)致突發(fā)的神經(jīng)元去極化。門冬氨酸具有很強(qiáng)的細(xì)胞親和力，能夠增加鉀離子內(nèi)流。因此，門冬氨酸鉀可以通過調(diào)節(jié)鉀離子穩(wěn)態(tài)平衡來降低TBI損傷。此外，門冬氨酸參與能量代謝，提高ATP的生成，這可能與其神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)。

門冬氨酸鉀治療作用的研究中發(fā)現(xiàn)門冬氨酸鉀在大鼠的半數(shù)致死劑量為1250 mg/kg，因此本研究選擇的62.5 mg/kg劑量應(yīng)在安全范圍內(nèi)。結(jié)果顯示，大鼠腦創(chuàng)傷后急性給予62.5 mg/kg劑量的門冬氨酸鉀能顯著提高CCI后24和72 h的神經(jīng)功能評(píng)分，并明顯降低CCI后72 h大鼠的皮質(zhì)損傷體積。該結(jié)果與以前在腦缺血模型中得出的結(jié)果相似，提示門冬氨酸鉀對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。

有研究發(fā)現(xiàn)TBI與卒中風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[17]，TBI引起腦血管系統(tǒng)損傷后，血供不足，從而誘發(fā)卒中；另外，腦外傷引起凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的改變和血管剝離，都會(huì)增加卒中風(fēng)險(xiǎn)[18]。因此，不同于以往對(duì)腦損傷治療效果的研究都只觀察神經(jīng)功能缺損評(píng)分和損傷體積的測量[13，19]，本研究增加了對(duì)腦組織血流灌注量指標(biāo)的觀察。影響腦血流量的因素主要是腦動(dòng)脈壓、靜脈壓和腦血管的阻力，而腦血管對(duì)腦內(nèi)化學(xué)環(huán)境變化，神經(jīng)元信號(hào)和血管內(nèi)壓力的變化具有迅速適應(yīng)和反應(yīng)的能力[20]。本研究中，影響腦血流變化的主要因素應(yīng)該是腦血管阻力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)大鼠的腦灌注量有顯著差異，這應(yīng)該是皮質(zhì)打擊引起的，打擊即刻對(duì)腦皮質(zhì)的機(jī)械損傷直接導(dǎo)致腦灌注量下降，而這一變化在打擊后30 min最為明顯：此時(shí)已出現(xiàn)一系列繼發(fā)性損傷事件，包括興奮毒性作用、凋亡、線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)等[21]，這些繼發(fā)損傷都會(huì)對(duì)腦血管內(nèi)壓力產(chǎn)生影響，造成腦灌注量下降。隨著時(shí)間的進(jìn)展，在打擊后90和120 min測量的腦灌注量有上升的趨勢(shì)，推測可能與腦血流的自動(dòng)調(diào)節(jié)功能有關(guān)。組間比較顯示，溶劑對(duì)照組和門冬氨酸鉀組的腦灌注量單位明顯下降，提示CCI模型制作成功，但兩組大鼠的腦灌注量之間差異無顯著性，可能是門冬氨酸鉀對(duì)血流變化沒有明顯作用。

Klatzo[22]在1967年就提出了腦水腫的兩種主要形式：細(xì)胞毒性水腫或血管源性水腫，分別由細(xì)胞損傷或血腦屏障降解產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外水聚集。第三種形式稱為間質(zhì)水腫，在1992年由Milhorat[23]提出。細(xì)胞毒性水腫的特點(diǎn)是血腦屏障完整，但細(xì)胞膜上的鈉鉀泵功能障礙，導(dǎo)致水由間質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和從血液進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)[24]。結(jié)果，大量的鈉離子在細(xì)胞內(nèi)聚集，由于滲透壓的改變，細(xì)胞攝入水分后隨即腫脹。門冬氨酸鉀能降低大鼠CCI后的腦水含量，應(yīng)該與其改善鈉鉀ATP酶活性，增加鉀離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而減輕細(xì)胞毒性水腫有關(guān)。

腦組織損傷后組織ATP含量的迅速下降并引起繼發(fā)性腦損傷已被證實(shí)[25]。門冬氨酸能形成草酰乙酸，參與三羧酸循環(huán)和尿素循環(huán)，生成ATP，為機(jī)體供能。在本研究中，門冬氨酸鉀能減少CCI后大鼠的ATP下降，這可能與門冬氨酸的作用有關(guān)。同時(shí)，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，溶劑對(duì)照組的乳酸含量明顯增加，而給予門冬氨酸鉀治療后乳酸水平較溶劑對(duì)照組下降，這是因?yàn)槿毖鯒l件下，糖酵解產(chǎn)生的丙酮通過乳酸途徑進(jìn)一步上升，因此在損傷組織中，乳酸含量應(yīng)該上升。該結(jié)果也與ATP含量結(jié)果一致，證實(shí)了門冬氨酸鉀在能量代謝過程中起到的供能作用。

ATP的缺失可以引起能量依賴的膜離子泵功能障礙，如鈉鉀ATP酶。鈉鉀ATP酶是一種廣泛存在的血漿膜蛋白，在細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的維持中起關(guān)鍵作用[26]。有研究證實(shí)TBI能損傷鈉鉀ATP酶的活性，并且提高該酶的活性對(duì)TBI的治療是有益的[27-29]。本研究結(jié)果證實(shí)CCI引起鈉鉀ATP酶活性下降，并且門冬氨酸鉀治療改善了這一酶活性，因此，門冬氨酸鉀對(duì)鈉鉀ATP酶活性的提高可能是其神經(jīng)保護(hù)作用的治療機(jī)制之一。

門冬氨酸鉀對(duì)大鼠腦損傷的研究在國內(nèi)外鮮有報(bào)道，本研究在門冬氨酸鉀對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷和可控性皮質(zhì)打擊傷方面均做了初步探索，獲得了門冬氨酸鉀對(duì)大鼠腦損傷的有效治療劑量。此外，該研究對(duì)門冬氨酸鉀在臨床的應(yīng)用有一定指導(dǎo)作用，如果腦損傷的患者需要使用鉀補(bǔ)充劑時(shí)，可以考慮使用門冬氨酸鉀，因其改善鈉鉀ATP酶的活性在補(bǔ)鉀的同時(shí)也具有神經(jīng)保護(hù)作用。但本研究仍有不足之處，本研究為急性腦損傷的機(jī)制研究，而TBI的長期預(yù)后是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，對(duì)其恢復(fù)期持續(xù)癥狀的產(chǎn)生，如腦灌注量下降，認(rèn)知功能受損等沒有良好的神經(jīng)生物學(xué)解釋[30-31]；在今后的研究中，應(yīng)該觀察門冬氨酸鉀對(duì)腦損傷的長期作用效果，并增加認(rèn)知功能方面的評(píng)價(jià)，以更加完善其作用機(jī)制的研究。

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