紀忠偉 楊羽茜 李勝龍 張博淼 李云龍 黃躍南

結直腸癌是世界上常見的惡性腫瘤，早期結直腸癌（Ⅰ期和Ⅱ期）患者的5年生存率在60%以上；50%以上的患者在確診時已經發(fā)生遠處轉移（為Ⅲ期或Ⅲ期以上），5年生存率下降到10%，化療和手術治療仍是重要的治療手段，也是提高生存率的唯一途徑［1］。奧沙利鉑（oxaliplatin）是常用于結直腸癌化療的第三代鉑類藥物，然而，結直腸癌化療無效的一個重要原因是腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥。

一、奧沙利鉑在結直腸癌化療中的耐藥機制

奧沙利鉑是第三代鉑類藥物，常用于結直腸癌、胃癌、胰腺癌的化療，通過主動轉運進入細胞，與細胞內的親核分子結合，主要是DNA，也與RNA和蛋白質結合，在兩個鄰近的鳥嘌呤之間或鳥嘌呤與腺嘌呤之間形成鏈內加合物，而破壞DNA復制和轉錄［2］。在結直腸癌化療中，奧沙利鉑耐藥的分子機制主要涉及核酸切除修復系統(tǒng)（nucleic acid excision repair system，NER）、微小RNA、細胞膜表面三磷酸腺苷結合盒轉運體（ATP-binding cassette transporters, ABC轉運體）等。

1.NER：NER是高度保守的DNA修復途徑，修復DNA損傷，改變DNA分子的螺旋結構并干擾DNA復制和轉錄。該系統(tǒng)修復過程的重要步驟包括識別DNA受損特定區(qū)域的損傷和分界，形成復合物以解開受損部分并將其切除，最后，切除后的區(qū)域被重新正確合成并連接以保持DNA分子的完整［3］。在體內順鉑和奧沙利鉑導致的DNA損傷能被NER系統(tǒng)修復，NER系統(tǒng)中核酸切除修復交叉互補因子-1和其催化因子XPF（ERCC4）在核苷酸切除修復中起著重要的作用，被證明參與奧沙利鉑的耐藥［4］，其它蛋白如XPF和XPG（ERCC5）也與奧沙利鉑耐藥有關。但也有研究表明，修復交叉互補因子-1水平降低與奧沙利鉑誘導的細胞周期阻滯有關，與耐藥性的產生或DNA修復能力的改變無關［5］，因此仍需要進一步研究。

2.微小RNA（MicroRNAs）：MicroRNAs（miRNA）是非編碼RNAs，通過模板序列以堿基互補的方式結合到靶信使RNAs上，導致靶信使RNAs降解或轉錄抑制。研究表明miRNAs突變與人類腫瘤獲得性耐藥密切相關，在體外過度表達miR-153，miR-203，miR-143，通過相應地調整FOXO3a，ATM激酶和IGF-1R而影響奧沙利鉑的耐藥性［6］。臨床試驗中，結直腸患者血漿中過度表達miR27b和miR-148a，與以奧沙利鉑為基礎的一線化療耐藥和無進展生存期縮短相關，而過度表達miR-326與總體生存率下降相關［7］。

3.細胞膜表面ABC轉運體（ABC transporters）：腫瘤細胞藥物流出轉運體ABC家族在轉出細胞內的化療藥物方面起著重要的作用，特別指出的是ABC亞家族，包含多藥耐藥相關蛋白已經證明參與鉑類藥物的耐藥［8］，在體外卵巢癌模型中，多藥耐藥相關蛋白1和多藥耐藥相關蛋白4能增加ABC轉運體的基因表達及與氨基端相關的糖基化，這對減少癌細胞中化療藥物的累積及增加對化療藥物的耐藥性起著重要作用［8］。

以奧沙利鉑為基礎的化療方案目前已成為轉移性或晚期結直腸癌化療的標準方案。然而，單獨使用奧沙利鉑在體內并沒有顯示出足夠高的抗腫瘤活性，主要歸因于靜脈給藥后人體對藥物有劑量限制性的毒副作用，藥物在腫瘤組織的累積濃度低，以及腫瘤細胞對藥物的耐藥。一般而言，癌癥化療的效果受到化療藥物對正常細胞和組織的毒副作用以及多藥耐藥發(fā)展的限制，這些局限性是由于抗腫瘤藥物對腫瘤細胞缺乏選擇性以及它們對靶組織的低遞送率。iRGD肽作為一種靶向肽與化療藥物結合，可以使化療藥物最大化地遞送到腫瘤組織內，同時使其在正常組織中的累積和毒性最小化。

二、iRGD肽的結構及逆轉腫瘤耐藥機制

iRGD是腫瘤組織特異性穿透肽，通過荷瘤鼠體內噬菌體文庫篩選出來，具有靶向特定腫瘤的能力，已經證明能選擇性遞送化療藥物和顯像劑至腫瘤的特定部位［9-10］。iRGD肽包含兩個氨基酸基序，即RGD基序和R/KXXR/K基序（即CendR基序），由9個氨基酸組成，即CRGDKGPDC，易與靶腫瘤細胞表面的神經纖毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP-1）受體結合，增加對靶腫瘤細胞膜的通透性［11-12］。靜脈注射iRGD后，iRGD與在腫瘤脈管系統(tǒng)中特異性表達的αv整聯(lián)蛋白結合，然后被水解加工成CRGDK/R，在C-末端暴露出活性的CendR基序，CendR基序與NRPS相互作用，激發(fā)穿過組織的主動容量轉運系統(tǒng)（active bulk transport system），使結合iRGD的藥物甚至游離但與iRGD共同施用的藥物在腫瘤組織內滲透和擴散［9，12］。首先，RGD 基序與整合素的 αvβ3和αvβ5受體結合，而這些受體主要在腫瘤內皮細胞中表達，在腫瘤的其他細胞中也有表達，這很可能使iRGD肽在腫瘤組織的擴散中起重要作用，而血管內皮是iRGD肽進入腫瘤細胞的大門。其次，蛋白酶切割事件（Protease cleavage event）激活CendR基序（R/KXXR/K），這種蛋白酶沒有被確定，可能是弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣酶，因為CendR基序是這些蛋白酶首選識別基序。組織穿透肽一致通過R/KXXR/K基序與NRP結合，增加血管滲透性和分子通過組織的轉運。R/KXXR/K基序不具有活性，除非它占據肽的C端位置，因此稱為C-end Rule基序（CendR motif）［13］。CendR基序是這些蛋白酶的首選識別基序，蛋白酶切割需要與整合素結合，而有CendR基序但不與整合素結合的肽類是無作用的，因此與整合素結合的前提限制了iRGD肽靶向腫瘤的作用。最后，CendR基序結合NRP-1或神經纖毛蛋白-2（NRP-2），進而激活內吞作用/胞吐轉運通路，此通路即為CendR通路［11，13-14］。此通路由iRGD激發(fā)，在增強化療藥物向腫瘤組織遞送中起重要作用，而NRP-1和NRP-2是調節(jié)血管通透性的關鍵分子［15］。

三、CendR通路的細胞生物學

CendR通路始于細胞的內吞作用步驟，該步驟與已知的內吞細胞通路明顯不同。CendR內吞囊泡與巨噬細胞囊泡最相似，但與經典的巨胞飲不同，因為CendR通路需要神經纖毛蛋白受體，另一明顯區(qū)別是CendR通路通過細胞和組織的營養(yǎng)缺乏來提高活性，在營養(yǎng)素供應豐富的情況下，反應低下，營養(yǎng)物質通過中心營養(yǎng)感受器mTOR發(fā)揮其對CendR通路的作用［16］。CendR通路的mTOR調節(jié)主要通過調節(jié)NRP-1的表達來發(fā)揮作用。盡管營養(yǎng)素缺乏增強了通路的活性，但實際仍需要通過NRP-1激發(fā)。在mTOR活性較高的腫瘤中，mTOR調節(jié)CendR通路的一個必然結果是iRGD不能有效地將藥物輸送到具有高水平mTOR活性的腫瘤中，mTOR抑制劑雷帕霉素（rapamycin）與iRGD肽結合能增加腫瘤中CendR通路的遞送效率［16］。

當CendR通路處于激活狀態(tài)時，形成的內吞囊泡很大，平均直徑約200 nm，可以容納相當數量的細胞外液，如果細胞外液中含有化療藥物，和納米顆粒一樣作為荷載物儲存在這些內吞囊泡中，必要時大量釋放到通路中，這種情況說明了CendR通路的一個重要特點，除了共價連接的有效荷載物外，也能轉運與iRGD肽一起施用但不與其結合的有效荷載，即旁觀者效應（by-stander effect）［17］。iRGD荷載在腫瘤組織中的傳遞意味著能將有效載荷從一個細胞遞送到另一個細胞。CendR通路是一個主動轉運通路，需要消耗能量［18］，細胞與細胞之間CendR通路荷載物的轉運已經在培養(yǎng)的腫瘤細胞和內皮細胞中證實［18］，最初的內吞過程很好理解，但是細胞間轉運的途徑和分子機制的信息很少。從已經攝取CendR通路有效荷載的細胞釋放的外泌體含有效荷載，表明外泌體轉運作為細胞間轉運的一種機制，即使在有能溶解納米顆粒但不滲透膜的化合物存在下，銀納米顆粒也可以從一個細胞轉運到另一個細胞，這與CendR有效載荷受到生物膜（如外泌體）保護的觀點一致。另一種假設細胞間轉運是通過微米或納米管來完成的，已經證明在腫瘤細胞之間或腫瘤細胞和內皮細胞之間管狀導管的存在，細胞內的大分子通過這些導管從一個細胞轉運到另一個細胞［19-20］。在短距離內通過這些管道傳輸的效率比外泌體傳輸更高［20］，這種機制可以解釋CendR通路跨組織轉運的有效性和傳輸速度。

iRGD肽通過與神經纖毛蛋白（neuropilin，NRP）相互作用增加腫瘤血管通透性將藥物遞送到血管外腫瘤組織中。在iRGD中的兩個活性基序中，NRP結合的CendR基序在抗轉移方面起重要作用，而整合素結合的RGD基序似乎只是將肽帶到腫瘤組織或細胞中，因為沒有CendR基序的RGD肽缺乏抗轉移活性［13］。NRP-1和NRP-2在腫瘤細胞中高度表達，并且已經證實在腫瘤轉移中起作用［12，15］。iRGD結合NRP-1和NRP-2，抗腫瘤轉移可能是通過兩種NRPs共同作用的結果。其抗轉移作用由NRP結合的CendR基序介導，而不是由與整合素結合的RGD基序介導。iRGD抑制腫瘤細胞的遷移并引起體外化學排斥依靠CendR和NRP-1，該肽引起細胞急劇崩潰和部分細胞脫離，導致驅避活性，表明CendR在整聯(lián)蛋白功能調節(jié)中起重要作用［17］。當該肽用于藥物遞送至腫瘤的靶向肽時，iRGD的抗轉移活性可以提供顯著的附加益處。

研究表明腫瘤細胞遷移是轉移級聯(lián)的關鍵步驟，涉及細胞突起的動態(tài)調節(jié)，細胞突起介導細胞粘附，提供移動的牽引力，并感知吸引或排斥細胞的環(huán)境信號。一些細胞遷移抑制劑通過折疊額細胞突起來消除前向牽引，幫助細胞改變方向，起到化學治療劑的作用。包括天然CendR分子Semaphorin 3A（Sema 3A）在內的各種化學治療藥物通過抑制腫瘤侵襲來抑制轉移［22］。iRGD肽，是一個有力的轉移抑制劑，通過CendR基序結合NRP-1抑制腫瘤細胞遷移和化療耐藥，活細胞成像研究表明，iRGD提供了收回細胞突起的線索，并且一致地排斥了遷移的腫瘤細胞群，該作用依賴NRP結合CendR基序，因為CRGDC（非CendR對照肽）無效，并且iRGD在Transwell測定中的化學誘導被阻斷性抗NRP-1b1b2抗體顯著抑制［21］。這些發(fā)現(xiàn)證明了iRGD的CendR依賴性化學傾向性質，并提供了抗轉移作用的潛在機制。

綜上所述，iRGD肽通過穿透效應、滯留效應以及主動靶向作用，將化療藥物特異地遞送到腫瘤組織內，最低限度地降低化療藥物在正常組織細胞內的累積，降低藥物的毒副作用，增強化療效果。研究表明，當iRGD肽用作化療藥物遞送的輔助療法時，將同時發(fā)揮抑制腫瘤轉移的作用。iRGD的抗轉移作用可以用于預防初始轉移，抑制已發(fā)生轉移的再轉移，以及克服抗血管生成療法中的促轉移副作用［21-23］。目前研究僅在動物實驗模型和細胞培養(yǎng)上，但是人類腫瘤對iRGD肽增強治療的真正效果只能在臨床試驗中確定，有待于進一步研究。