研究背景

人類和嚙齒類動物影像學(xué)研究表明，扣帶回在疼痛感覺過程中處于持續(xù)激活狀態(tài)。嚙齒類疼痛模型動物前扣帶回(ACC)體外電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ACC與疼痛記憶有關(guān)。然而，基于細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)化學(xué)、纖維聯(lián)系以及不同的活動模式區(qū)分扣帶回亞區(qū)的功能研究仍很少，并且這些解剖學(xué)的差異如何轉(zhuǎn)化為功能上的差異仍是未知。盡管疼痛異常敏感病人MCC呈持續(xù)激活狀態(tài)，但是MCC在疼痛中的作用并不明確。此外，關(guān)于其通路及作用區(qū)域的機(jī)制研究也未見報(bào)道。該研究在清醒的小鼠上進(jìn)行光遺傳操作、環(huán)路研究和功能性評估，討論了MCC在傷害性感受、急性疼痛和疼痛過程中亞急性可塑性中的具體作用。

主要研究結(jié)果

該研究使用重組Camk2a啟動子的腺病毒載體(rAAV-CaMKII-ArchT-Venus)將古紫質(zhì)質(zhì)子泵（ArchT，黃光控制）和光敏感通道視紫紅質(zhì)蛋白2（ChR2，藍(lán)光控制）導(dǎo)入MCC全層來抑制或刺激MCC神經(jīng)元活動，光纖的最佳位置通過c-Fos表達(dá)情況來確定，并通過全細(xì)胞膜片鉗和體內(nèi)四極電極記錄來檢測操縱神經(jīng)元活動的有效性。

將辣椒素注入小鼠后爪后， MCC各層神經(jīng)元中c-Fos蛋白表達(dá)顯著增加。在辣椒素注射后15～30 min內(nèi)，黃光激活A(yù)rchT以阻斷MCC神經(jīng)元活動，c-Fos表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著減少。但是辣椒素誘發(fā)的急性疼痛行為并沒有減輕。黃光作用于表達(dá)ArchT的大腦第一軀體感覺皮質(zhì)后肢區(qū)(S1HL)時(shí)也產(chǎn)生相似的結(jié)果。使用雙纖維方法同時(shí)抑制MCC和S1HL也不會影響辣椒素誘發(fā)的急性疼痛行為，這表明辣椒素誘發(fā)的急性痛存在多種通路。

同樣，ArchT介導(dǎo)的MCC或S1HL抑制對足底機(jī)械性刺激（von Frey纖維）引發(fā)的后爪急性縮腿行為沒有影響。同時(shí)抑制MCC和S1HL神經(jīng)元活動，小鼠對有害和無害機(jī)械性刺激的敏感性增強(qiáng)，這一作用僅發(fā)生在黃光照射的時(shí)間內(nèi)，此后并沒有持續(xù)。該結(jié)果表明，MCC與第一軀體感覺區(qū)(S1)共同參與疼痛抑制通路的緊張性調(diào)節(jié)。

接著，研究者在傷害性活動誘導(dǎo)的中樞可塑性模型中探討了MCC和S1HL的功能。利用病毒注射小鼠，研究者觀察到MCC和S1HL的活動對于C纖維傷害性感受器誘發(fā)中樞可塑性是必需的。在后爪注射辣椒素后15～30 min內(nèi)抑制MCC或S1HL活動并用von Frey纖維刺激，發(fā)現(xiàn)機(jī)械性痛覺過敏消失。然而，在辣椒素注射后45～60 min接受機(jī)械性刺激，對照小鼠（僅接受光纖植入）和S1HL抑制小鼠表現(xiàn)出明顯的高敏感性，而MCC 抑制小鼠則沒有這種表現(xiàn)。表明MCC而非S1HL皮層神經(jīng)元的持續(xù)興奮在痛覺過敏的維持過程起作用。

在辣椒素注射后15～30 min僅在機(jī)械性刺激期間抑制MCC活動，痛覺超敏反應(yīng)受到抑制，但在45～60 min又完全恢復(fù)持久性痛敏。這表明，與刺激無關(guān)的MCC神經(jīng)元持續(xù)活動對于與痛覺敏化有關(guān)的皮質(zhì)回路的長期興奮非常重要。體內(nèi)電生理記錄也顯示，在辣椒素注射后15～30 min后，痛覺超敏行為明顯，MCC活動持續(xù)增加。

為了探討MCC持續(xù)興奮性活動對傷害性活動誘導(dǎo)的中樞可塑性的影響，研究者在辣椒素注射后不同階段對MCC進(jìn)行了抑制。在辣椒素注射后0～15 min（痛覺感受器激活期）持續(xù)抑制MCC神經(jīng)元活動，在15～30 min時(shí)完全阻止了機(jī)械性超敏反應(yīng)。然而，這些小鼠在45～60 min時(shí)又出現(xiàn)了機(jī)械性痛覺超敏現(xiàn)象，盡管明顯低于對照小鼠。為了確定這是否由MCC神經(jīng)元的持續(xù)興奮引起，研究者僅在辣椒素注射后30～45 min內(nèi)抑制表達(dá)ArchT小鼠的MCC活性，發(fā)現(xiàn)在45～60 min時(shí)顯著降低了機(jī)械敏感性。

相反，在表達(dá)ArchT和ChR2的小鼠，在局部注射辣椒素后15～30 min內(nèi)用黃光刺激，在45～60 min內(nèi)以藍(lán)光(473 nm) 刺激MCC（激活MCC神經(jīng)元），小鼠機(jī)械性痛覺敏感性顯著增強(qiáng)，這和記憶的恢復(fù)過程類似。這些結(jié)果表明，在急性外周C傷害性纖維激活后，MCC神經(jīng)元在不同時(shí)相的持續(xù)活動對于誘導(dǎo)和維持痛覺過敏反應(yīng)相關(guān)的中樞可塑性來說是必需的。

研究者測試了急性抑制MCC是否可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的長期超敏反應(yīng)。在足底注射完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)的長期炎癥性疼痛模型中，在CFA后24小時(shí)，黃光照射ArchT表達(dá)小鼠的MCC，部分但顯著地減輕了機(jī)械性痛覺過敏。與此相反，周圍神經(jīng)病變（坐骨神經(jīng)損傷模型，SNI）引起的機(jī)械性異常疼痛在很大程度上不受急性抑制MCC的影響，這表明MCC對長期疼痛具有選擇性作用，炎性痛與神經(jīng)病理性疼痛引起的機(jī)械性痛覺超敏具有不同的中樞機(jī)制，而MCC參與炎性痛誘發(fā)的機(jī)械性痛覺超敏。

接下來，研究者檢測了MCC活動本身是否足以誘導(dǎo)行為可塑性改變。在表達(dá)ChR2小鼠MCC切片，持續(xù)15 min的全細(xì)胞記錄顯示，在整個(gè)15 min的光照周期內(nèi)，錐體神經(jīng)元持續(xù)激活，與藍(lán)色光照強(qiáng)度改變成正比。與10 Hz相比，在20 Hz和30 Hz頻率下MCC神經(jīng)元的動作電位明顯增加。在清醒的表達(dá)ChR2小鼠上進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)，觀察到在同側(cè)和對側(cè)MCC中c-Fos表達(dá)神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加。用藍(lán)光激活表達(dá)ChR2小鼠MCC神經(jīng)元，同時(shí)以von Frey纖維機(jī)械性刺激爪底，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)明顯的機(jī)械性痛覺超敏行為，這類似于外周傷害性刺激誘導(dǎo)的痛敏。

本文作者之后研究了MCC環(huán)路是否參與中樞可塑性。在研究的10個(gè)與疼痛感覺有關(guān)的腦區(qū)中，只有伏隔核(NAc)、后島葉(PI)以及鄰近腦區(qū)屏狀核c-Fos表達(dá)模式呈雙向調(diào)控，這與在無辣椒素時(shí)通過ChR2激活MCC或通過ArchT抑制MCC聯(lián)合足底注射辣椒素時(shí)痛覺超敏反應(yīng)的雙向變化一致。研究者還觀察到內(nèi)側(cè)丘腦的活性在MCC激活和辣椒素處理時(shí)都沒有變化。盡管在追蹤實(shí)驗(yàn)中，研究者觀察到基底外側(cè)杏仁核在結(jié)構(gòu)上接受來自MCC興奮性神經(jīng)元的傳入，但在杏仁核中并未看到特異性的MCC驅(qū)動的c-Fos蛋白表達(dá)。在與MCC有解剖關(guān)系的前額前邊緣和下邊緣皮層，抑制MCC幾乎完全抑制辣椒素誘導(dǎo)的c-Fos表達(dá)。然而，直接光刺激MCC并沒有引起邊緣前皮層和邊緣下皮層產(chǎn)生明顯的c-Fos表達(dá)，這提示連接的復(fù)雜性和間接性。同樣，前島葉、S1HL和中央杏仁核在抑制和激活MCC時(shí)，c-Fos表達(dá)沒有出現(xiàn)雙向變化。因此，只有PI和NAc表現(xiàn)出c-Fos表達(dá)的雙向變化，與MCC活性的雙向變化高度吻合。因此，研究者推測從MCC到PI和NAc的下行投射會影響痛覺可塑性和痛覺過敏的誘導(dǎo)。

為了進(jìn)一步研究激活的MC-PI和MCC-NAc投射是否在功能上參與了痛覺過敏的誘導(dǎo)，研究者利用光遺傳技術(shù)直接刺激或抑制MCC到PI或NAc的投射。首先，用表達(dá)改良的ArchT即 eArchT的腺病毒來感染單側(cè)MCC神經(jīng)元。然后，在對側(cè)后肢注射辣椒素激活MCC后15～30 min的行為測試中，通過在目標(biāo)區(qū)域（PI或NAc）放置光纖進(jìn)行光照抑制表達(dá)。抑制單側(cè)MCC-NAc投射在早期階段僅對對側(cè)后爪的機(jī)械性超敏反應(yīng)產(chǎn)生很小的影響，并且在后期的測試中并沒有效果。與表達(dá)GFP的小鼠相比，表達(dá)eArchT小鼠用黃光照射單側(cè)MCC-PI投射，不僅在注射辣椒素后15～30 min，而且在45～60 min明顯抑制了對側(cè)后爪的機(jī)械性超敏反應(yīng)。在另一組小鼠中，直接抑制MCC-PI通路的靶區(qū)即PI神經(jīng)元，辣椒素誘導(dǎo)的機(jī)械痛覺超敏反應(yīng)被抑制。在沒有辣椒素刺激的情況下，抑制MCC-PI投射后基礎(chǔ)痛覺敏感性沒有變化。因此，抑制PI再現(xiàn)了抑制MCCPI投射所引起的主要表型變化。

在第二種方法中，研究者通過病毒使MCC興奮性神經(jīng)元表達(dá)ChR2，并將光纖分別置于投射區(qū)PI或Nac來直接光照激活MCC-PI投射和MCCNAc投射。與只表達(dá)GFP的小鼠相比，藍(lán)光照射表達(dá)ChR2的MCC-PI投射，而不是表達(dá)ChR2的MCC-Nac投射，在無后爪注射辣椒素的情況下，誘導(dǎo)了顯著的機(jī)械性超敏反應(yīng)。因此，直接刺激MCC-PI投射，而不是MCC-NAc投射，很大程度重現(xiàn)了刺激MCC興奮神經(jīng)元時(shí)觀察到的超敏反應(yīng)。

調(diào)節(jié)MCC-PI或MCC-Nac投射并沒有影響運(yùn)動機(jī)能和功能，說明這些行為結(jié)果沒有受到運(yùn)動功能的明顯干擾，而且MCC-PI投射并不參與MCC引發(fā)的恐懼反應(yīng)。

最后，研究者試圖探討MCC和MCC-PI通路是否僅通過脊髓上機(jī)制導(dǎo)致傷害性行為的敏化，或者它們是否通過下行調(diào)制作用于脊髓傷害性過程。研究者用30 Hz刺激表達(dá)ChR2小鼠MCC神經(jīng)元或MCC-PI投射。光遺傳激活ChR2表達(dá)小鼠MCC或MCC-PI通路誘導(dǎo)發(fā)生明顯的超敏反應(yīng)，但對鞘內(nèi)注射格拉司瓊（5-HT拮抗劑）的小鼠卻沒有作用，表明在MCC以及MCC-PI通路的促疼痛功能中，下行5-HT起重要作用。單獨(dú)注射格拉司瓊對基礎(chǔ)機(jī)械性痛敏無影響。熒光共聚焦顯微鏡顯示，PI發(fā)出興奮性投射至中縫大核（下行5-HT能投射的起點(diǎn)）。這些都提示MCC-PI通路作用于下行5-HT易化系統(tǒng)而誘發(fā)機(jī)械性痛覺超敏。

綜上所述，MCC-PI投射在C纖維激活后產(chǎn)生并維持傷害性痛覺超敏反應(yīng)，在缺乏條件性傷害性傳入的情況下，激活MCC-PI通路足以誘發(fā)痛覺超敏，并且不引起刺激依賴的恐懼或負(fù)面情緒。

討 論

關(guān)于扣帶回亞區(qū)功能的劃分仍不清楚。盡管關(guān)于人類影像學(xué)已經(jīng)證明ACC亞區(qū)與疼痛、厭惡情緒具有廣泛的相關(guān)性，但是由于缺乏干預(yù)操作，它們與痛覺超敏之間的因果聯(lián)系尚不明確。該研究結(jié)果揭示了MCC腦區(qū)可以調(diào)控小鼠的痛覺過敏，但不能調(diào)控小鼠的急性疼痛或與情感相關(guān)的行為。

雖然光遺傳學(xué)不能同時(shí)靶向整個(gè)MCC所有的神經(jīng)細(xì)胞和亞區(qū)，但是在被照射區(qū)域內(nèi)控制80%的興奮性神經(jīng)元的活動就足以調(diào)節(jié)痛覺可塑性，但不能調(diào)節(jié)急性疼痛或情緒。對ACC在嚙齒類動物疼痛中的作用研究表明，ACC在疼痛相關(guān)負(fù)面情緒中具有特異性作用，但在疼痛感覺中卻不起作用。大多數(shù)關(guān)于扣帶回功能對痛覺影響的研究都是針對于rACC，而該研究著眼于MCC，并基于靶向特定功能的亞區(qū)和闡明環(huán)路的作用，在細(xì)胞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)水平分析疼痛的不同組成部分。

研究數(shù)據(jù)顯示，雖然S1皮質(zhì)和MCC對于強(qiáng)烈的痛覺傳入誘導(dǎo)早期行為可塑性很重要，但是只有MCC興奮性神經(jīng)元的持續(xù)活動才會在中止外周傳入后過渡到亞急性痛敏的維持中起作用。關(guān)于病理性疼痛狀態(tài)的長期可塑性，研究者觀察到MCC對炎癥性疼痛和神經(jīng)性疼痛的不同作用。盡管這兩種慢性疼痛狀態(tài)都涉及中樞可塑性，但人們普遍認(rèn)為，它們的機(jī)制和潛在途徑存在很大差異，不僅涉及到周邊傳入因素，還涉及到參與中樞神經(jīng)環(huán)路。目前，膠質(zhì)細(xì)胞依賴性的機(jī)制和與情感、情緒和獎賞相關(guān)的環(huán)路是神經(jīng)性疼痛的決定因素。該研究觀察到急性抑制MCC神經(jīng)元可以部分地但是明顯地逆轉(zhuǎn)炎癥性痛覺過敏。

通過光遺傳抑制或激活MCC，暫時(shí)控制MCC活動以及基于c-Fos的腦區(qū)描繪，研究揭示了MCC是調(diào)節(jié)超敏感狀態(tài)環(huán)路的關(guān)鍵點(diǎn)，為MCC在受到刺激時(shí)能快速作出行為適應(yīng)控制提供了功能證據(jù)，這些已經(jīng)在人類影像學(xué)研究中得到了預(yù)測?；赾-Fos的活動圖譜，研究者觀察到MCC相關(guān)網(wǎng)絡(luò)跨越幾個(gè)皮層和皮層下區(qū)域，包括最近被證明可以調(diào)節(jié)中樞疼痛處理的前額皮質(zhì)的其他區(qū)域。然而，功能聯(lián)系最明確的是MCC與PI、NAc和屏狀核。

該研究尚未確定MCC和MCC-PI通路是如何控制感覺過敏的。有幾種可能的機(jī)制，如調(diào)節(jié)預(yù)期的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（包括MCC而非rACC），影響注意力，調(diào)節(jié)特殊神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（其中包括MCC作為接頭），調(diào)節(jié)上行脊髓丘腦和丘腦皮質(zhì)傷害性信息傳入到PI，或者通過下行控制途徑調(diào)節(jié)脊髓傷害性信息處理過程。MCC在解剖學(xué)上也與扣帶運(yùn)動前區(qū)有關(guān)，該區(qū)域被認(rèn)為是可以直接控制對刺激威脅作出適應(yīng)性運(yùn)動反應(yīng)。最近的研究表明，在疼痛期間激活的MCC腦區(qū)和運(yùn)動控制腦區(qū)之間存在緊密的重疊。有多條證據(jù)顯示PI與編碼強(qiáng)度有關(guān)，因此，MCC-PI連接可能利用PI的這一功能在疼痛過程中增強(qiáng)疼痛感覺。MCC調(diào)控痛覺過敏的最終下游過程是通過脊髓痛覺加工的下行易化來實(shí)現(xiàn)的，而不是依賴于上述MCC激活后的脊髓上機(jī)制。事實(shí)上，PI在解剖學(xué)上和功能上都與中縫大核相關(guān)，這是5-HT能調(diào)控的起點(diǎn)。研究者發(fā)現(xiàn)MCC-PI通路通過招募下行5-HT能機(jī)制來影響痛覺。起源于中縫大核的5-HT能通路在脊髓中發(fā)揮了顯著的促進(jìn)調(diào)節(jié)作用，最近有報(bào)道稱，光遺傳激活腦干5-HT能神經(jīng)元可誘發(fā)痛覺過敏。

關(guān)于皮層可塑性是否僅僅反映了在痛覺通路初始部分的活動依賴性致敏現(xiàn)象，或者皮層的結(jié)構(gòu)和功能可塑性是否會導(dǎo)致病理性疼痛，還存在爭論。該研究認(rèn)為僅激活MCC-PI投射，就能產(chǎn)生不依賴于外周傷害性信息傳入的痛覺過敏。這對沒有明顯損傷或身體疾病的病人的疼痛敏感性的變化（或是在治療后的持續(xù)疼痛）具有重要意義。因此，該研究為心理社會因素加重疼痛提供了一種可能機(jī)制，這些因素可能會抑制MCC和PI的基本活動。綜上所述，該研究結(jié)果提示皮層神經(jīng)環(huán)路參與從急性疼痛到長期疼痛的轉(zhuǎn)變。