樓姣英+金哲+李洋

[摘要] 目的 探討中藥清毒栓含藥血清對宮頸癌SiHa細(xì)胞產(chǎn)生免疫相關(guān)細(xì)胞因子的影響。方法 選取SPF級SD大鼠雌性30只[體重（220±10）g]，分成兩組，分別用純凈水和中藥灌胃處理后抽血提取含藥血清，設(shè)立空白對照組（0%含藥大鼠血清）、清毒栓低、中、高劑量組（濃度分別為1%、4%、8%含藥大鼠血清），采用q-PCR法檢測細(xì)胞IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ的基因表達(dá)情況，采用Western Blot法檢測SiHa細(xì)胞內(nèi)IL-8、TNF-α的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 不同劑量的清毒栓含藥血清在12 h、24 h、48 h對宮頸癌SiHa細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞因子的基因表達(dá)均有一定促進(jìn)表達(dá)作用，其中以IL-8、TNF-α在8%濃度含藥血清給藥后12～24 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P<0.05）；細(xì)胞內(nèi)IL-8、TNF-α蛋白表達(dá)量在高劑量組給藥后48 h呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。結(jié)論 高劑量清毒栓含藥血清可顯著誘導(dǎo)免疫相關(guān)細(xì)胞因子IL-8、TNF-α基因的表達(dá)，并能夠使細(xì)胞內(nèi)IL-8、TNF-α蛋白的表達(dá)量增加，其作用機(jī)制可能是通過促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)量來增加相應(yīng)細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 免疫相關(guān)細(xì)胞因子；SiHa細(xì)胞；中藥清毒栓；含藥血清

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）30-0033-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of traditional Chinese medicine Qingdu suppository-containing serum on immune-related cytokines in SiHa cells of cervical cancer. Methods SPF grade SD rats（body weight of 220±10）g were selected， with 30 female rats， which were divided into two groups. The drug-containing serum was collected by blood drawing after the treatment of pure water and Chinese medicine gavage respectively. The blank control group （0% drug-containing rat serum）， low， medium and high dose group of Qingdu suppository （concentrations of 1%， 4%， 8% of drug-containing rat serum） were set. The gene expression of IL-2， IL-8， TNF-α and IFN-γ was detected by q-PCR method， and the protein expression of IL-8 and TNF-α within SiHa cells was detected by Western Blot method. Results Different doses of Qingdu suppository-containing serum all showed a certain effect of expression promotion on the gene expression of immune-related cytokines in SiHa cells of cervical cancer at 12 h， 24 h， 48 h. The level of IL-8 and TNF-α was in a significantly increasing trend within 12 to 24 hours after the administration of 8% drug-containing serum（P<0.05）； the protein expression volume of IL-8 and TNF-α in the cells was in a significantly increasing trend within 48 hours after the administration in the high-dose group. Conclusion The Qingdu suppository-containing serum in the high dose group can significantly induce the gene expression of immune-related cytokines IL-8 and TNF-α， and can increase the expression volume of intracellular IL-8 and TNF-α protein. Its mechanism may be by promoting the expression volume of related genes to increase the expression of the corresponding cytokine protein.

[Key words] Immune-related cytokines； SiHa cells； Chinese medicine Qingdu suppository； Drug-containing serum

宮頸癌在女性癌癥中位居第二位，其發(fā)病率有逐年升高趨勢，目前已經(jīng)明確人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌的首要病因[1]。在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，HPV感染后的細(xì)胞免疫功能下降是一個(gè)重要因素，導(dǎo)致病毒在體內(nèi)持續(xù)存在并向腫瘤發(fā)展。臨床研究已經(jīng)證實(shí)中藥清毒栓具有消除HPV的作用[2-4]，前期的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示，中藥清毒栓可通過多種途徑參與抗腫瘤作用[5-12]。細(xì)胞免疫因子IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ是影響細(xì)胞免疫功能的重要因素?；谝郧暗难芯?，我們推測中藥清毒栓可以通過促進(jìn)相關(guān)免疫因子基因的表達(dá)，進(jìn)而增加相應(yīng)細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)來起抗腫瘤作用。本研究以宮頸癌SiHa細(xì)胞為研究對象，探討中藥清毒栓對宮頸癌SiHa細(xì)胞免疫因子基因及蛋白表達(dá)量的影響，從分子水平上探討中藥在宮頸癌細(xì)胞中抗腫瘤的機(jī)制。endprint

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取SD雌性大鼠30只，體重為（220±10）g。購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[京動(dòng)許字（2000）第004號總049號]。隨機(jī)分成空白血清組中藥清毒栓組，每組15只。

SiHa細(xì)胞培養(yǎng)分組：陰性對照組（不加血清，即正常對照組）、空白對照組（加空白血清，即0%含藥大鼠血清）、清毒栓低、中、高劑量組（濃度分別為1%、4%、8%含藥大鼠血清）。每組各5例。

1.1.2藥物與試劑 中藥清毒栓（主要由莪術(shù)30 g、黃柏15 g、紫草15 g、金銀花15 g等組成），將復(fù)方藥物分別醇提（紫草）、提油（莪術(shù)）、水煎（黃柏）去渣濃縮后配成藥液，濃度約為4.2 g/mL，高溫消毒后于4℃冰箱密封保存。由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所制備。

細(xì)胞總RNA提取試劑盒，購自北京愛普拜生物技術(shù)有限公司；DNase I， Amplification Grade，購自Invitrogen公司；GoScriptTM Reverse Transcription System，購自Promega公司；SsoAdvancedTM SYBR Green Supermix，購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3 細(xì)胞株 人宮頸癌SiHa細(xì)胞，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.4 儀器 普通PCR儀（C1000TM Thermal Cycler）、紫外凝膠成像（Bio-Rad Gel Doc XR+）、電泳儀（Powerpac）、微型離心機(jī)（Tornado），均購自美國Bio-Rad公司；4℃高速離心機(jī)（2-16PK），購自德國Sigma公司；微量分光光度計(jì)（NanoQTM），購自博奧生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1提取含藥血清 每日給藥一次（灌胃），每只（220±10）g大鼠灌藥量為（4.2±0.1）mL。連續(xù)灌服5 d，采血前12 h禁食，末次給藥1 h后采集全部血液（盡可能多的采血）；采全血后分離含藥血清，進(jìn)行含藥血清的無菌處理。

1.2.2 q-PCR法檢測 IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ的基因表達(dá)情況：① 總RNA提取SiHa細(xì)胞傳代后，分別加入3 mL含有不同濃度（8%、4%、1%和0%）含藥血清和不含藥大鼠血清（1%）的MEM新鮮培養(yǎng)基（含有10%FBS和1g/L青霉素+鏈霉素），均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，分別在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，分別提取RNA。具體為：（1）取1 mL RNA提取緩沖液試劑于6-well中，渦旋混勻，室溫放置10 min，其間渦旋3～4次；（2）加入200 μL三氯甲烷，渦旋混勻并室溫放置10 min，其間渦旋3～4次；（3）4℃，13000 rPm離心15 min；（4）吸500 μL上清，加入500 μL異丙醇，輕柔混勻；（5）上吸附柱。待混合液全部完畢，用700 μL RPW清洗柱子兩遍，每遍離心30 s；（6）將柱子空轉(zhuǎn)離心2 min；（7）充分晾干沉淀，用50 μL 65℃預(yù)熱的RNA Free Water溶解沉淀；（8）取1 μL進(jìn)行電泳檢測。

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及q-PCR檢測 首先在PCR管中加入總體積為11.5 μL的預(yù)混試劑（分別為RNA 5 μg、Oligo（dT）15 Primer 0.5 μg、Nuclease-Free Water 6 μg）。然后，將混合物進(jìn)行70°C下5 min預(yù)變性，完成后取出置于冰上。另外，配制預(yù)混試劑RT-Mix（分別為GoScriPtTM 5X Reaction Buffer4 μL、MgCl2 2 μL、PCR Nucleotide Mix1 μL、Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.4 μL、GoScriPtTM Reverse TranscriPtase 1 μL，共計(jì)8.4 μL），向上述預(yù)變性完成的每個(gè)樣品中加入10 μL RT-Mix。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序，包括退火、延伸、逆轉(zhuǎn)錄酶失活三步，反應(yīng)條件：25℃：5 min；42℃：60 min；70℃：15 min；4℃：60 min，程序完成后得到cDNA。最后，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，進(jìn)行q-PCR檢測。設(shè)計(jì)引物序列見表1。

1.2.3 Western blot法檢測免疫因子的蛋白表達(dá)量 選取q-PCR法檢測中基因表達(dá)顯著增加的免疫因子，運(yùn)用Western blot法檢測其蛋白表達(dá)量情況，其具體操作步驟如下：（1）蛋白提取及濃度測定：取出SiHa細(xì)胞2×105個(gè)放入打樣管用加入蛋白提取緩沖液進(jìn)行打磨，將破碎好的樣品在冰上放置1 h，用低溫離心機(jī)離心（4℃，13 000 rPm，20 min）；吸取上清放入1.5 mL離心管中再次使用低溫離心機(jī)離心處理（4℃，13 000 rPm，20 min）后吸取上清備用。之后采用Bradford方法測定蛋白樣品的濃度；（2）轉(zhuǎn)膜：完成SDS-PAGE操作后，紫外激發(fā)后觀察蛋白電泳狀況，之后將此蛋白膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，轉(zhuǎn)膜用的夾子按照海綿-whatman濾紙-膠-PVDF膜-whatman濾紙-海綿-透明夾子部分夾好后用Bio-Rad濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作；將整個(gè)裝置放置于大的冰盒中，加入TB-transfer buffer（恒流：400 mA）轉(zhuǎn)膜2 h；（3）封閉：轉(zhuǎn)膜完畢后，使用WB Enhancer Solution處理膜10 min，之后用PBS洗凈，再用5%的脫脂奶粉（用PBS配置）封閉液進(jìn)行封閉，室溫下2 h或者4℃封閉過夜；（4）加入一抗：每個(gè)目標(biāo)蛋白的一抗的稀釋度為1：1000；（5）洗膜：PBST（PBS+0.1%Tween 20）洗5次，每次5 min；（6）加入二抗：每個(gè)目標(biāo)蛋白的二抗的稀釋度為1：1000；（7）洗膜：PBST洗5次，每次5 min后，加入超敏化學(xué)發(fā)光液處理3～5 min后直接儀器觀察并照相。endprint

1.3 觀察指標(biāo)

免疫因子IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ的基因表達(dá)和IL-8和TNF-α蛋白的表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 q-PCR法檢測細(xì)胞因子mRNA表達(dá)

不同濃度含藥血清于不同時(shí)間對SiHa細(xì)胞免疫相關(guān)因子mRNA表達(dá)結(jié)果見表2、表3、表4。在相同的時(shí)間內(nèi)，IL-8、TNF-α的mRNA表達(dá)在12 h、24 h都呈上升趨勢，48 h后下降。通過重復(fù)測量方差分析的檢驗(yàn)，IL-8、TNF-α在1%濃度和8%濃度給藥后12～24 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P<0.05）。綜合表2、表3、表4，通過兩兩比較發(fā)現(xiàn)，對于特定的免疫因子，IL-2僅在24 h后檢測出表達(dá)量，在12 h、24 h均未能檢測出表達(dá)，且隨著含藥血清濃度增加，mRNA表達(dá)增加。IL-8、TNF-α的mRNA表達(dá)隨著含藥血清濃度增加而增加，在相同時(shí)間內(nèi)，24～48 h內(nèi)增加的濃度顯著大于12～24 h內(nèi)增加的濃度（P<0.05）。

2.2 Western blot法檢測結(jié)果

細(xì)胞內(nèi)IL-8、TNF-α蛋白表達(dá)量在含藥血清作用不同時(shí)間表達(dá)情況是定性實(shí)驗(yàn)，每組挑選1個(gè)樣品進(jìn)行試驗(yàn)，其灰度數(shù)值見表5、表6，Western blot電泳見圖1。細(xì)胞內(nèi)IL-8蛋白表達(dá)量在8%濃度給藥后12～24 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升的趨勢，TNF-α蛋白表達(dá)量在8%濃度給藥后12～24 h呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。

3討論

宮頸癌是臨床上最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女健康。有研究表明[13-14]中醫(yī)藥所含有的抗腫瘤成分可以通過直接細(xì)胞毒作用或提高免疫力等途徑來達(dá)到抗腫瘤作用。中藥復(fù)方具有“天然組合化學(xué)庫”之稱，作用機(jī)制可能是通過多種藥物的藥理效應(yīng)共同起作用的結(jié)果，所以相對單一成分藥物，復(fù)方中藥有可能在療效上更具有優(yōu)勢[15]。清毒栓主要是由莪術(shù)、黃柏、紫草等組成的復(fù)方中藥。莪術(shù)抗腫瘤效應(yīng)的研究已經(jīng)達(dá)到分子水平，研究證實(shí)其主要成分姜黃素[16]具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，對處于各增殖周期的細(xì)胞均有不同程度的抑制作用。對于清毒栓抗腫瘤的分子機(jī)制，國內(nèi)目前已有相當(dāng)?shù)难芯炕A(chǔ)。曹穎等[17]通過檢測主要組織相容性復(fù)合物-Ⅰ（MHC-Ⅰ）抗原呈遞通路相關(guān)分子TAP1、TAP2、LMP2、LMP7的蛋白及基因表達(dá)差異，認(rèn)為中藥清毒栓可通過調(diào)節(jié)抗原呈遞通路相關(guān)分子的蛋白及基因表達(dá)，起到促進(jìn)抗原呈遞的作用，這可能是該方療效的作用機(jī)制之一。金哲等[18]通過流式細(xì)胞技術(shù)，認(rèn)為清毒栓及β-欖香烯可以上調(diào)HLA-Ⅰ蛋白及基因表達(dá)，從而加強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞系HeLa表面的抗原呈遞，可能是這兩種藥物幫助機(jī)體清除人乳頭瘤病毒（HPV）感染及癌變細(xì)胞的機(jī)制之一。本研究從免疫因子的角度出發(fā)，通過檢測經(jīng)不同藥物濃度處理的SiHa宮頸癌細(xì)胞中常見免疫因子IL-8、TNF-α的基因表達(dá)情況，并檢測基因表達(dá)增高的因子蛋白表達(dá)量的變化，擬在免疫因子角度解釋清毒栓抗腫瘤作用。

本研究表明，不同劑量的清毒栓在12 h、24 h、48 h對宮頸癌SiHa細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞因子的基因表達(dá)均有一定促進(jìn)作用，其中以IL-8、TNF-α在8%濃度給藥后12～24 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P<0.05）。腫瘤壞死因子（TNF-α）是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的一種多肽激素，是一種重要的細(xì)胞因子，是多種生理反應(yīng)和免疫過程的重要介質(zhì)[19]。IL-8是由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，主要促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞趨化、脫粒、釋放溶酶以加強(qiáng)炎癥防護(hù)；促進(jìn)T 細(xì)胞趨化游走以加強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)[20]。這提示清毒栓可通過促進(jìn)IL-8、TNF-α的基因表達(dá)來提高機(jī)體抗腫瘤能力，尤其是高劑量的清毒栓，對刺激基因的表達(dá)更為有效，但是具體通過哪一種途徑激活相關(guān)基因的表達(dá)，需要進(jìn)一步深入至分子信號通路途徑方面的研究。通過進(jìn)一步檢測IL-8、 TNF-α蛋白表達(dá)情況，分析表達(dá)量隨時(shí)間濃度的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)IL-8、 TNF-α蛋白表達(dá)量在高劑量組給藥后48 h呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P<0.05）。這證實(shí)高劑量的清毒栓可能通過刺激IL-8、 TNF-α基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)IL-8、 TNF-α蛋白的表達(dá)。明確清毒栓主要起刺激作用的免疫因子，對進(jìn)一步研究清毒栓抗腫瘤機(jī)制的免疫學(xué)研究有重要指導(dǎo)作用。

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（收稿日期：2017-08-22）endprint