王璐琳 ，王瑞云 ，，何杰麗 ，薛延桃 ，陳 凌 ，王海崗 ，喬治軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西 太谷 030801）

糜子（Panicum miliaceum L.），又叫黍稷，為禾本科黍?qū)?，是我?guó)古老作物之一，在小雜糧作物中占有重要地位，栽培歷史悠久[1-2]，具有抗鹽抗旱等優(yōu)良特性[3-4]，由于糜子對(duì)各種土壤都有極好的適應(yīng)能力，所以，在我國(guó)北方干旱半干旱地區(qū)具有很大的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)[5-8]。近年來(lái)，隨著對(duì)小雜糧研究的逐漸深入，糜子的保健功能逐漸被世人認(rèn)可[9]。不管是對(duì)糜子的表觀研究還是分子水平的研究，都已成為人們的研究熱點(diǎn)。連帥等[10]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)外糜子地方品種和野生資源的遺傳多樣性進(jìn)行了研究；王瑞云等[11]利用熒光SSR對(duì)我國(guó)糜子的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。近幾年，農(nóng)業(yè)部將糜子列入了產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系，這對(duì)于糜子新品種選育、高產(chǎn)栽培技術(shù)研究、種質(zhì)資源的鑒定和優(yōu)異基因挖掘都具有很好的促進(jìn)作用。加速開(kāi)展分子生物學(xué)技術(shù)在糜子這一作物上的研究應(yīng)用，對(duì)于提高糜子整體研究水平具有重要意義。

SSR標(biāo)記在分子標(biāo)記中的應(yīng)用較為廣泛，其原理是：在所有的真核生物基因組中，都存在一類由1～6個(gè)堿基序列串聯(lián)而成的DNA堿基序列，由于等位基因不同而重復(fù)數(shù)不同，可根據(jù)重復(fù)序列兩側(cè)保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種微衛(wèi)星標(biāo)記序列是由保守序列決定，且有染色體位點(diǎn)的特異性，因此，大多數(shù)真核生物的遺傳標(biāo)記來(lái)源于此。SSR分子標(biāo)記技術(shù)擁有高度多態(tài)信息含量（PIC）豐富的分子標(biāo)記[12]，即簡(jiǎn)單重復(fù)序列，長(zhǎng)度一般較短，廣泛的分布在基因組不同的位置[13]。SSR分子標(biāo)記的共顯性好、多態(tài)性豐富，因而，成為糜子最實(shí)用的檢測(cè)標(biāo)記技術(shù)。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了70個(gè)三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記，本試驗(yàn)基于這些標(biāo)記設(shè)計(jì)引物，對(duì)來(lái)源不同的糜子品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，篩選具有多態(tài)性的引物，為糜子資源的遺傳差異提供分子檢測(cè)工具。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選取來(lái)自不同生態(tài)區(qū)的6份糜子材料（表1），種植于營(yíng)養(yǎng)缽中，于三葉期剪取新鮮葉片，提取基因組DNA。

表1 6個(gè)耐鹽性篩選黍子品種的名稱、編號(hào)、生態(tài)栽培區(qū)及來(lái)源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SSR引物的設(shè)計(jì)與合成 利用primer5.0設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)時(shí)遵循A堿基不能在3′端出現(xiàn)，上下游引物的退火溫度之間相差不要太大（表2）。

表2 引物設(shè)計(jì)參數(shù)

1.2.2 基因組DNA的提取與檢測(cè) 采用改良后的CTAB法提取糜子全基因組DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳以及紫外微量核酸儀來(lái)檢測(cè)DNA的質(zhì)量、純度和濃度，最后稀釋成10倍備用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系（20 μL）：ddH2O 13.8 μL，dNTPs 1.6 μL，Taq 聚合酶 0.4 μL，前后引物各 0.6 μL，10×buffer 2.0 μL，DNA 模板 1.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃5 min；變性94℃45 s，退火 50 s，延伸 72 ℃ 1 min，共 38 個(gè)循環(huán)；后延伸72℃10 min。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳 將SSR PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳緩沖液10×TBE，電壓 200 V，時(shí)間 2.5 h，用 AgNO3進(jìn)行染色，在LED燈光工作臺(tái)上進(jìn)行觀察并讀取特異性條帶。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)電泳結(jié)果中有無(wú)擴(kuò)增的條帶，有記錄記為1，沒(méi)有記為0，以此方法來(lái)記錄不同糜子品種在同一引物中的等位點(diǎn)基因的變異情況，然后利用power marker V3.25軟件計(jì)算各引物的多態(tài)性信息含量（PIC），利用Rp＝∑Ib，Ib＝1-（2×|0.5-P|）公式計(jì)算引物分辨率（Resolving power，Rp）。其中，Ib表示某個(gè)等位基因信息量；P表示某個(gè)等位基因在6份材料中出現(xiàn)的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 70對(duì)SSR引物的多態(tài)性篩選

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，70對(duì)SSR引物中有67對(duì)引物可以擴(kuò)增出條帶（圖 1，2），3對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增結(jié)果（圖 3）。67對(duì)有擴(kuò)增片段的引物中，17對(duì)DNA條帶呈多態(tài)性（圖 2），50對(duì)為單態(tài)（圖 1）。

2.2 17對(duì)SSR引物的遺傳參數(shù)分析

從表3可以看出，17個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到47個(gè)等位變異；每個(gè)位點(diǎn)等位變異數(shù)為2～4個(gè)，平均為2.8個(gè)。其中，RYW87 最高，RYW82，RYW92，RYW97，RYW102最低。

17個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量（PIC）為0.239 2～0.6713，平均為 0.4321，其中，RYW87 最高，RYW89，RYW92，RYW97，RYW102最低。就PIC值而言，6個(gè)位點(diǎn)（RYW86，RYW87，RYW88，RYW91，RYW99，RYW101）大于0.5，為高度多態(tài)性位點(diǎn)；7個(gè)位點(diǎn)（RYW90，RYW93，RYW94，RYW95，RYW96，RYW98，RYW100）為0.25～0.5，為中度多態(tài)性位點(diǎn)；4個(gè)位點(diǎn)（RYW89，RYW92，RYW97，RYW102）小于 0.25，為低度多態(tài)性位點(diǎn)。

17個(gè)位點(diǎn)的基因多樣性指數(shù)為0.2778～0.7223，平均為0.4902；其中，RYW87最大，RYW89，RYW92，RYW97，RYW102最小。17個(gè)SSR的片段大小為175～375 bp，最大為 RYW86，最小為 RYW98。

表3 6個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳參數(shù)

2.3 17對(duì)引物的特征參數(shù)

表4 17對(duì)引物的特征參數(shù)

17對(duì)多態(tài)性引物的分辨率如表4所示。結(jié)果 表明，SSR標(biāo)記的分辨率介于0.333 3～2.333 3，其中，RYW87最高，RYW91，RYW102最低。從圖 4可以看出，SSR標(biāo)記在0～1之間的分布頻率為41%，1～2，2～3的分布頻率分別為53%和6%。

3 討論

近年來(lái)，隨著科研技術(shù)的日漸發(fā)達(dá)，分子生物學(xué)在各個(gè)行業(yè)不斷興起，我國(guó)自古以來(lái)就是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，擁有比較豐富的作物品種資源，豐富的作物品種資源促進(jìn)了重要基因庫(kù)遺傳改良的建立，奠定了培育優(yōu)良、高產(chǎn)新品種的堅(jiān)實(shí)物質(zhì)基礎(chǔ)，大大減少了育種家的工作強(qiáng)度，因此，必須深入了解作物的遺傳背景和親緣關(guān)系等，有效利用這些豐富的種質(zhì)資源，為日后育種及品種遺傳基礎(chǔ)的多樣性提供保障。

目前，人們通過(guò)形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記或DNA分子標(biāo)記來(lái)對(duì)物種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，前3種比較容易受到環(huán)境、植物生長(zhǎng)發(fā)育和人為因素的影響，所以，結(jié)果不太準(zhǔn)確。而DNA分子標(biāo)記中，常用的方法有RELP，RAPD，AFLP，SSR和SNP等。其中，SSR以其基因組的豐富度高，遺傳表現(xiàn)為共顯性，同時(shí)對(duì)DNA質(zhì)量要求較低，但其重復(fù)性以及多態(tài)性水平較高，而且隨著近幾年高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，成本也較低，受到人們的青睞。

HU等[14]首先利用其他物種的SSR標(biāo)記對(duì)我國(guó)的糜子進(jìn)行遺傳多樣性研究，由于SSR引物的種間差異使得其通用性較低，因此，想要準(zhǔn)確對(duì)糜子資源進(jìn)行更為深入的研究，急需開(kāi)發(fā)來(lái)自糜子基因組的特異性SSR標(biāo)記。CHO等[15]通過(guò)構(gòu)建糜子基因組的基因文庫(kù)，成功開(kāi)發(fā)了25個(gè)SSR標(biāo)記，并在此基礎(chǔ)上，HUNT 等[16]、董俊麗等[2]、王瑞云等[11]、連帥等[17]和劉笑瑜等[18]利用上述SSR分子標(biāo)記評(píng)估國(guó)外和我國(guó)的糜子資源。董俊麗等[2]選用19個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)來(lái)自俄羅斯和中國(guó)的96份糜子資源進(jìn)行分析，結(jié)果表明，基因多樣性指數(shù)和PIC值分別為0.409 7和0.392 0；同時(shí)對(duì)這些資源進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)和聚類分析，結(jié)果表明，聚類分析將資源分為3個(gè)類群，且2種方法有一定程度的類似，分布與環(huán)境有密切的關(guān)系。連帥等[17]選用5對(duì)SSR引物對(duì)5個(gè)糜子生態(tài)區(qū)的40個(gè)糜子資源進(jìn)行多樣性分析，共檢測(cè)出15個(gè)等位點(diǎn)基因，平均為3個(gè)，遺傳多樣性指數(shù)和PIC值分別為0.76和0.48。劉笑瑜等[18]選用6對(duì)SSR引物對(duì)來(lái)自我國(guó)不同省份的40份糜子資源進(jìn)行遺傳多樣性研究，共發(fā)現(xiàn)20個(gè)等位點(diǎn)變異，其中，平均遺傳多樣性指數(shù)和PIC值分別為0.542 6，0.3403。王瑞云等[10]利用15對(duì)糜子熒光特性SSR標(biāo)記對(duì)來(lái)自我國(guó)的132份糜子資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到107個(gè)等位點(diǎn)變異，幅度在2～14個(gè)，平均為7個(gè)，基因多樣性指數(shù)平均為0.529 8，PIC值平均為0.486 4，高于本次試驗(yàn)（0.425 6），其聚類和遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)果相似與試材的地理起源有密切的關(guān)系。然而這些試材中的PIC值普遍較低且不足的是SSR標(biāo)記還是較少，對(duì)于豐富的糜子資源很難全面準(zhǔn)確地進(jìn)行遺傳多樣性分析，所以，開(kāi)發(fā)大量來(lái)自本物種基因組DNA的SSR標(biāo)記的需求是極其迫切的，但是礙于當(dāng)時(shí)技術(shù)水平有限，無(wú)法快速開(kāi)發(fā)出大量SSR分子標(biāo)記。王瑞云等[19]運(yùn)用該高基元分子檢測(cè)系統(tǒng)評(píng)估我國(guó)糜子資源的遺傳差異，結(jié)果表明，聚類群組與地理起源相關(guān)，其中，北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)遺傳多樣性最豐富。

SSR分子標(biāo)記已經(jīng)在在大豆[20]和棉花[21]等經(jīng)濟(jì)作物上廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)通過(guò)利用6個(gè)不同省份的糜子對(duì)70對(duì)SSR引物進(jìn)行多樣性篩選，共篩選出17對(duì)具有多態(tài)性的引物，后續(xù)試驗(yàn)將利用這17條引物對(duì)更多糜子基因型進(jìn)行遺傳多樣性分析，為糜子分子標(biāo)記輔助育種提供檢測(cè)工具。

［1］WANG R Y，HUNT H V，QIAO Z J，et al.Diversity and cultivation of broomcorn millet（Panicum miliaceum L.）in China:A Review[J].Economic Botany，2016，7（3）：1-11.

［2］董俊麗，王海崗，陳凌，等.糜子骨干種質(zhì)遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（16）：3121-3131.

［3］Wang R Y，Wang H G，Liu X Y，et al.Drought-induced transcription of resistant and sensitive common millet varieties[J].The Journal of Animal&Plant Sciences，2017，27（4）：1303-1314.

［4］郭琦.中國(guó)糜子（Panicum miliaceum L.）種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［5］王綸，王星玉，溫琪汾，等.中國(guó)黍稷種質(zhì)資源研究與利用[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2005，6（4）：474-477.

［6］王綸，王星玉，溫琪汾，等.中國(guó)黍稷種質(zhì)資源蛋白質(zhì)和脂肪含量的鑒定分析[J].中國(guó)遺傳資源學(xué)報(bào)，2007，8（2）：165-169.

［7］張盼盼，馮佰利，王鵬科，等.干旱條件下糜子葉片衰老與保護(hù)酶活性的變化[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2010，28（2）：99-108.

［8］劉敏軒，張宗文，陸平，等.黍稷種質(zhì)資源芽、苗期耐中性混合鹽脅迫評(píng)價(jià)與耐鹽生理機(jī)制研究 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（18）：3733-3743.

［9］PARK M Y，JANG H H，KIMJ B，et al.Hog millet（Panicum miliaceum L.）-supplemented diet ameliorates hyperlipidemia and hepatic lipid accumuion in C57BL/6J-ob/obmice[J].Nutr Res Pract，2011（5）：511-519.

［10］連帥，陸平，喬志鈞，等.利用SSR分子標(biāo)記研究國(guó)內(nèi)外黍稷地方品種和野生資源的遺傳多樣性 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49（17）：3264-3275.

［11］王瑞云，季煦，陸平，等.利用熒光SSR分析中國(guó)糜子遺傳多樣性[J].作物學(xué)報(bào)，2017，43（4）：530-548.

［12］季煦，王瑞云，曳水瑛，等.基于SSR的中國(guó)糜子遺傳多樣性分析 [J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版），2015，35（2）：137-142.

［13］朱彩梅，張京.應(yīng)用SSR標(biāo)記分析中國(guó)糯大麥種質(zhì)的遺傳多樣性[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2010，11（1）：57-64.

［14］HU X Y，WANG J F，LU P，et al.Assessment of genetic diversity in broom-corn millet（Panicum miliaceum L.）using SSR markers[J].Journal of Genetics and Genomics，2009，36：491-500.

［15］ CHO R J，MINDRINOS M，RICHARDS D R，et al.Genome wide mapping with biallelic markers in Arabidopsis thaliana[J].Nature Genetics，1999，23：203-207.

［16］HUNT H V，CAMPANA M G，LAWES M C，et al.Genetic diversity and phylogeography of broomcorn millet（Panicum miliaceum L.）across Eurasia[J].Molecular Ecology，2011，22：4756-4771.

［17］連帥，王瑞云，馬躍敏，等.不同生態(tài)區(qū)糜子種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析 [J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，35（3）:225.

［18］劉笑瑜，王瑞云，劉敏軒，等.利用SSR標(biāo)記分析40份糜子資源的遺傳多樣性[J].分子植物育種，2016，14（6）：1631-1636.

［19］王瑞云，劉笑瑜，王海崗，等.用高基元微衛(wèi)星標(biāo)記分析中國(guó)糜子遺傳多樣性[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（20）：3848-3859.

［20］張東輝，史國(guó)敏.分子標(biāo)記在大豆遺傳育種中的實(shí)踐[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（8）：1381-1383.

［21］孫亞莉，何守樸，陳瓊玲，等.SSR標(biāo)記與棉花產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)性分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：591-595.