李有清， 梁稱福

(湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林學(xué)院，湖南 衡陽 421000)

藍(lán)莓(VacciniumSpp)，杜鵑花科(Ericaeae)越橘屬(Vaccinium)多年生灌木.其小漿果類果實皮較薄，其果肉酸甜可口，是一種具有很好的保健作用的水果，發(fā)祥地和主要的生產(chǎn)地都在北美洲地區(qū).當(dāng)前國內(nèi)外的藍(lán)莓主栽品種為高叢(Vacciniumcorymbosum)，矮叢(Vacciniumangustifolium)，兔眼(Vacciniumashei)三種.一方面，藍(lán)莓果實中包含了許多種類活性功能成分，比如花色素苷、黃酮等物質(zhì)，這些活性物質(zhì)能夠起到預(yù)防腦神經(jīng)衰老[1]、糖尿病等疾病發(fā)生的功效，同時又能增強心臟功能；另一方面，相關(guān)研究已經(jīng)證明，藍(lán)莓在眼疾和癌癥等疾病的預(yù)防上也具有很好的功效[2，3].藍(lán)莓因其極好的保健治療功能，在國際國內(nèi)都具有較好的聲譽[4].作為具有良好保健作用的水果之一，藍(lán)莓的廣泛栽培在二十一世紀(jì)具有很好的經(jīng)濟效益，能為解決農(nóng)民增收問題提供一個比較穩(wěn)定的產(chǎn)業(yè)項目[5].

二十世紀(jì)八十年代后期我國開始對藍(lán)莓進行引種馴化[6].一直以來，藍(lán)莓果實及其各種加工產(chǎn)品在海內(nèi)外十分暢銷，各大市場上的藍(lán)莓產(chǎn)品都存在很大的需求缺口[7].就市場上受歡迎度較高的兔眼藍(lán)莓來說，在我國除了江蘇、浙江和貴州等幾個省具備較大規(guī)模的集中栽培外，兔眼藍(lán)莓在我國南方許多地區(qū)仍然還在進行引種試種的栽培適應(yīng)性研究[8].由于藍(lán)莓扦插繁殖系數(shù)較低，且扦插后生根速度慢，還有較高的概率攜帶病毒，不利于擴大藍(lán)莓的栽培面積，常見的扦插繁殖方式很難滿足國內(nèi)市場對藍(lán)莓種苗的需求[9].而利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)需要的繁殖材料較少且繁殖系數(shù)較高，可以使用這種方法以快速繁殖種苗從而緩解目前苗木市場供應(yīng)困難的局面[10].同時，我國學(xué)者近年來在藍(lán)莓組培技術(shù)上的應(yīng)用研究已取得一定的成果.該文擬從藍(lán)莓組培無菌系建立的角度，分外植體的取材、滅菌方法和培養(yǎng)基的選擇三個部分進行綜述，以期整理目前為止國內(nèi)無菌系建立的方法、成果，為藍(lán)莓組培的進一步系統(tǒng)的發(fā)展提供思路及數(shù)據(jù)支持.

1 外植體的取材

在植物的組織培養(yǎng)當(dāng)中，外植體的選擇是否合適會在很大程度上影響初代培養(yǎng)的成功率.已有的研究表明，在選取材料部位上，在取材時間的確定上，外植體的存活率都會受到極大的影響.

1.1 取材部位

在藍(lán)莓組培應(yīng)用的研究中，學(xué)者們試驗了藍(lán)莓種子、休眠枝條、葉片和莖段或莖尖作為外植體的萌芽率、存活率、生根率等情況；而在實際的生產(chǎn)過程中，則通常會使用藍(lán)莓當(dāng)年萌發(fā)的帶腋芽的莖段或頂芽作外植體[11].之所以如此，主要是由于選擇莖段或頂芽作外植體具有操作簡單，成活率和增殖率高，且可以保持相關(guān)藍(lán)莓品種的種性等優(yōu)勢[12].另一方面，在國外，則使用藍(lán)莓葉片作外植體做研究或生產(chǎn)實踐所占比例較大[13].

國內(nèi)使用各品種藍(lán)莓莖段作為外植體的研究結(jié)果均表明，莖段適宜于用作藍(lán)莓組培外植體材料.涂俊凡等[14]、沙玉芬等[15]和張凱等[16]以都克藍(lán)莓為對象的研究表明，采用莖段作為外植體，都克藍(lán)莓的萌芽率都達(dá)到80%以上.趙興宇等[11]以大興安嶺野生藍(lán)莓莖段作為外植體，同樣有80%的莖段形成了愈傷組織.近幾年也有使用其它部位作外植體的研究報道.陽翠等[12]等使用萊格西藍(lán)莓品種一年生枝條做外植體，結(jié)果表明萌芽率能達(dá)到92.47%.

1.2 取材時間

研究發(fā)現(xiàn)，田間材料的取材時間對能否成功建立藍(lán)莓離體培養(yǎng)體系也存在很大的影響.在藍(lán)莓離體培養(yǎng)的芽誘導(dǎo)初期，不同取材時間對誘導(dǎo)芽萌發(fā)的效果不同，這種差異可能來自于植物體內(nèi)酚類化合物含量和多酚氧化酶活性的季節(jié)性變化.在芽萌發(fā)初期，葉片及新梢中酚類物質(zhì)較少，隨著新梢的生長，酚類物質(zhì)積累，多酚氧化酶活性增強，取樣外植體容易褐化，會影響初代培養(yǎng)效果.因此，探討出合適的外植體取材時期是誘導(dǎo)藍(lán)莓組培快繁成功與否的關(guān)鍵因素之一.

涂俊凡等[17]研究了兔眼藍(lán)莓外植體取材時間對萌發(fā)誘導(dǎo)效果的影響結(jié)果表明，4月下旬到6月上旬為兔眼藍(lán)莓莖段最佳取材時期，萌芽率為62.2%.王連潤等[18]在藍(lán)莓外植體取材時間對其誘導(dǎo)萌發(fā)率的影響研究中，發(fā)現(xiàn)選取藍(lán)莓當(dāng)年10月生，生長健壯，無病蟲害的枝條以及長有隱芽的莖段材料污染率低.梁曉晶等[19]對取自當(dāng)年不同時期的藍(lán)莓材料做了系統(tǒng)的組培試驗后得出結(jié)論，認(rèn)為4月份是藍(lán)莓組培外植體最佳的取材時期，并且還分析了這一結(jié)論的原因，主要是由于這段時間的莖段與4月以外的月份相比，分化出的愈傷組織不多，生長速度太快，形成的芽越發(fā)容易分化且同時褐變現(xiàn)象明顯，比其它取材時期獲得的材料減少.

在我國由于四季的更替比較顯著，因此，在氣溫較高、病蟲害比較容易爆發(fā)的6至9月間，用露地栽培的藍(lán)莓材料進行組織培養(yǎng)會有污染率較高的缺陷；與此相對地，當(dāng)年十月到第二年三月之間，盡管由于天氣寒冷，藍(lán)莓組培材料的污染率也相對不高，但此時的藍(lán)莓長勢也不太好，建立無菌系時無法獲得較高的成苗率.因此，建議選擇4月至6月氣候條件適宜的時期作為外植體取材時間.

2 外植體的滅菌

組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)中，滅菌至關(guān)重要，直接關(guān)系到組培苗誘導(dǎo)的成功率.在進行外植體消毒處理時，所用消毒劑的種類，消毒時間長短等都影響著外植體的污染率.因此，國內(nèi)外學(xué)者也做了許多相關(guān)研究，取得一定成果.

在植物組織培養(yǎng)技術(shù)中，常用的外植體消毒藥劑主要有75%的酒精，0.1%的氯化汞溶液等.而在進行研究試驗或者生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中，選用滅菌劑的種類和滅菌時間的確定等，則一般根據(jù)不同情況及操作者的經(jīng)驗來掌握.通常的消毒程序是先用75%的酒精棉擦拭外植體材料，然后使用消毒藥劑進行滅菌消毒，通常能獲得較好的滅菌消毒效果.然而不同的研究者會使用不同的滅菌劑及不同的外植體和滅菌時間，從而得到不同品種藍(lán)莓的最適宜的滅菌條件.常用消毒劑及其消毒效果見表1.

表1 常用消毒劑種類及消毒效果比較[22]

李麗容等[20]研究不同滅菌條件試驗結(jié)果表明，藍(lán)莓外植體(莖段)較好的滅菌方法為：70%酒精30 s+0.1%升汞6～8 min，其次是70%酒精30 s+2%次氯酸鈉8～10 min.劉明群等[21]認(rèn)為，對于藍(lán)莓外植體的滅菌，推薦采用0.2%升汞滅菌，且滅菌前后均不去葉柄，滅菌時間可依枝條采集時間及老嫩情況而定，一般宜控制在6～8 min.結(jié)合現(xiàn)有的研究來看，最有效的藍(lán)莓外植體材料滅菌程序一般是——剪取包含有強壯嫩芽的藍(lán)莓樹的休眠枝，拿自來水沖洗，這一步的主要目的是要除去藍(lán)莓枝表面的異物；然后拿滅菌過的蒸餾水浸泡藍(lán)莓枝20～30 min；隨后使用室內(nèi)插瓶水培的方法進行催芽，在長出的芽突破鱗片時，再把枝條剪成2～3 cm的莖段；接著，在超凈工作臺上用75%乙醇溶液進行處理，整個過程花費時間為3～4s，再用無菌水沖洗3～5次，然后用0.1%升汞溶液浸泡外植體約8 min，繼續(xù)用無菌水沖洗1～2次，沖洗時應(yīng)該要先快后慢；最后，將清洗消毒干凈的新枝條剪成0.5～1.0 cm長的莖段并立即接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng).

3 培養(yǎng)基的確定

在國內(nèi)外的藍(lán)莓組織培養(yǎng)試驗及實際生產(chǎn)當(dāng)中，藍(lán)莓莖段培養(yǎng)使用得最多的基本培養(yǎng)基大體上是MS、1/2MS、White、WPM、改良WPM、knops培養(yǎng)基和B5等七類.Wolfe利用這七類培養(yǎng)基，通過比較它們的培養(yǎng)效果后發(fā)現(xiàn)，WPM培養(yǎng)基在藍(lán)莓組織培養(yǎng)中作為基本培養(yǎng)基的效果是最好的[23].但是一般而言，都不會直接使用這幾種培養(yǎng)基，而是會稍作改良，常常是把WPM培養(yǎng)基中的K2SO4、CaCl2、FeSO4和Na2EDTA等鹽類用Ca(NO3)2·4H2O 684 mg/L、KNO3190 mg/L、C10H13FeN2NaO873.4 mg/L和鹽酸硫胺素0.1 mg/L代替，這樣的培養(yǎng)基被稱為改良型WPM培養(yǎng)基.盡管有這樣的改進，改良型WPM培養(yǎng)基以及基本培養(yǎng)基中的能量物質(zhì)一般只夠維持被培養(yǎng)物的基本生存所需，若是要得到較好的培養(yǎng)效果，必須得在基本培養(yǎng)基里添加相當(dāng)數(shù)量的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，如此方可誘導(dǎo)細(xì)胞的脫分化和再分化，從而最終發(fā)育為健康的試管苗.植物組織培養(yǎng)中用的較普遍的植物激素通常為生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素，而這些激素的種類、搭配比例等搭配方案對外植體的誘導(dǎo)效果間的差異是十分明顯的.研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中較高的生長素/細(xì)胞分裂素比值適宜用作生根培養(yǎng)；而較低的比值則適用于進行新芽的誘導(dǎo)；而在兩者的比例十分接近的情況下就更容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織.張力思等[24]進行的不同配比的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基對4種藍(lán)莓誘導(dǎo)效率的影響得出的結(jié)果是，在WPM基本培養(yǎng)基中加入玉米素(Zeatin)會提高增殖效率，加入反玉米素(Trans-Zeatin)則增殖效率適宜，加入反玉米素核苷(Trans-Zeatin Riboside)反而會降低增殖效率.董朝莉[25]試驗發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓莖段的離體增殖率會受到細(xì)胞分裂素種類、濃度的影響，并且發(fā)現(xiàn)使用ZT1～2 mg/L和2ip10～20 mg/L的效果較好.廉家盛[26]在使用美登藍(lán)莓進行不定芽分化培養(yǎng)時，用B5培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入2 mg/L ZT時誘導(dǎo)愈傷組織效率最高，進而分化出不定芽.在藍(lán)莓外植體增殖培養(yǎng)研究中，添加BA時，外植體也增殖，但其增殖率和成苗率均低于ZT的影響[27].也有研究發(fā)現(xiàn)在組織培養(yǎng)時，需要黑暗條件下培養(yǎng)1～2周，然后才能見光；若預(yù)先沒有在黑暗條件下進行培養(yǎng)，那么不管添加哪種細(xì)胞分裂素，分化率均比較低[28].

后期的初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基，都是以基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)再配合各階段對培養(yǎng)基的不同要求所進行的改良.劉作梅等[29]以一年生“南高叢”藍(lán)莓所作的研究表明，叢生芽誘導(dǎo)最適宜培養(yǎng)基為改良WPM+ZT1.0 mg/L，萌動率達(dá)95%；叢生芽增殖培養(yǎng)最適宜培養(yǎng)基為改良WPM+KT0.5 mg/L，且增殖系數(shù)為4.1.范淑芳等[30]采用陽光藍(lán)藍(lán)莓作離體繁殖研究結(jié)果表明，陽光藍(lán)組培苗的離體繁殖以帶2個芽莖段在WPM+2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA中進行增殖培養(yǎng)、在1/2WPM+0.10 mg/L IBA+1 000.0 mg/L AC中進行生根培養(yǎng)效果較佳.

4 存在的問題及解決對策

綜上所述，在藍(lán)莓組培無菌系建立的研究中，我國雖然取得了相當(dāng)大的成就，研究內(nèi)容比較廣泛，但研究的深度以及系統(tǒng)性不夠成熟，存在不少問題.具體表現(xiàn)在以下3個方面：

(1)一方面，在藍(lán)莓組培的過程中還存在較高的污染率，且分化率、生根率和移栽后種苗成活率都需要通過改進培養(yǎng)技術(shù)來得到進一步提高；另一方面，大規(guī)模藍(lán)莓組培過程中使用的大量甚至過量的消毒劑和殺菌劑等藥品，會帶來一系列的環(huán)境污染問題.因此，技術(shù)層面的創(chuàng)新，如尋找新的消毒劑殺菌劑等材料或者方法，進一步簡化規(guī)范化組培操作過程中的程序以減少污染率，試驗新的培養(yǎng)基組合以提高組培材料的分化率、生根率以及種苗的存活率等技術(shù)，將是日后藍(lán)莓組培的重要任務(wù).近幾年已經(jīng)有學(xué)者提出采用無糖培養(yǎng)微繁技術(shù)和開放式組培法兩種組培技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的組培技術(shù)[31]，以解決環(huán)境污染問題和組培種苗效率低下的缺陷.但這兩種方法在具體實施過程中的效果以及可能存在的負(fù)面效應(yīng)仍需積極探索，至少是值得嘗試的新的方法和技術(shù).

(2)國內(nèi)研發(fā)的許多藍(lán)莓品種的快繁體系在橫向上沒有系統(tǒng)的比較，還缺乏相同品種藍(lán)莓在縱向上的組織培養(yǎng)技術(shù)各個環(huán)節(jié)與過程的深入總結(jié)歸納和理論構(gòu)建.不同品種的藍(lán)莓在組培的相關(guān)環(huán)節(jié)會存在技術(shù)規(guī)程的細(xì)微差異，這些差異將對組培的效果產(chǎn)生較大的影響.因此，針對某些優(yōu)良品種的藍(lán)莓，應(yīng)當(dāng)充分試驗出其可靠標(biāo)準(zhǔn)的組培規(guī)程和方法，各個擊破，建立優(yōu)良藍(lán)莓品種的系統(tǒng)化組培程序.

(3)盡管我國對已有品種的藍(lán)莓組織培養(yǎng)獲得了數(shù)量相當(dāng)可觀的無性系建立案例，但依靠組織培養(yǎng)技術(shù)力量來進行新品種選育的研究還很少見，需要更成熟完善的藍(lán)莓組培技術(shù)體系或者操作規(guī)程.

因此，在未來的藍(lán)莓組培研究中，首先要創(chuàng)建能夠不受時空限制的國內(nèi)主栽藍(lán)莓品種離體再生和轉(zhuǎn)化體系，并且用基因技術(shù)優(yōu)化品種質(zhì)量提供技術(shù)支撐建設(shè)完備的大平臺.然后，增加對藍(lán)莓組培中植物生理變化過程的深入研究.最后，在理論構(gòu)建較完備，試驗數(shù)據(jù)足夠豐富的前提下，開展工廠化高效再生體系的研究以及基因轉(zhuǎn)化育種等方面的研究.

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