王 哲 王文波

(齊齊哈爾大學化學與化學工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

工藝·試驗

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法快速測定護肝片中五味子醇甲和五味子醇乙的含量

王 哲 王文波

(齊齊哈爾大學化學與化學工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，ESI離子源正離子模式選擇離子掃描模式對護肝片中五味子醇甲和五味子醇乙進行定量分析。五味子醇甲和五味子醇乙在一定范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，加樣回收率為98.41%和96.91%(n=6)。該方法快速、靈敏度高、選擇性好，適合測定護肝片中五味子醇甲和五味子醇乙的定量分析。

護肝片 五味子醇甲 五味子醇乙 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

護肝片是由柴胡、五味子、茵陳、板藍根、綠豆和豬膽粉六味中藥制成的中藥制劑，具有疏肝理氣，健胃消食的功能。具有降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，可用于慢性肝炎及早期肝硬化。方中的五味子有補腎寧心，收斂固澀的功能。對藥品中五味子醇甲和五味子醇乙的測定，方法多以HPLC為主[1～3]，本實驗創(chuàng)新采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定了護肝片中五味子醇甲和五味子醇乙含量，采用選擇離子采集的模式，可以大大縮短測定時間，補充了護肝片含量測定方法，此方法簡便，快捷，選擇性好，結(jié)果準確，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了方法。

1儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國沃特世公司ACQUITY超高效液相，Xevo G2 Q-TOF-MS質(zhì)譜儀，Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理軟件)；超聲清洗儀KQ-500E(昆山市超聲儀器有限公司)；Millipore-Q型超純水制備儀；Mettler AE240電子天平。

1.2 試藥

五味子醇甲對照品(批號：161031)；五味子醇乙對照品(批號：160920)均購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，實驗用護肝片(鼎鶴牌)(批號：20160306、20160416、20160430)；乙腈為進口Fisher試劑，水為超純機制水，其它試劑為分析純。

2實驗方法

2.1 對照品溶液的配制

分別精密稱取五味子醇甲和五味子醇乙對照品適量，加甲醇配制成每毫升含五味子醇甲0.300 0 mg、五味子醇乙0.100 0 mg的儲備液。

2.2 供試品溶液的配制

取護肝片20片，除去包衣，研細，取0.2 g，精密稱定，加乙酸乙酯8 mL，加熱回流30 min，放冷過濾，用8 mL乙酸乙酯分次洗滌濾渣及容器，洗液與濾液合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性對照溶液的制備

根據(jù)藥典護肝片的處方和制法，制出只含柴胡、茵陳、板藍根、綠豆和豬膽粉，不含有五味子的陰性樣品，再按上述方法制成陰性對照溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱選用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm,1.7 μm)，流動相為梯度洗脫(A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液)：1-5 min，A-B(40∶60)；5-7 min，100%A；7-8 min，A-B (40∶60),流速0.3 mL/min，進樣體積2 μL，柱溫為30 ℃。

2.5 質(zhì)譜條件

ESI源正離子模式，毛細管電壓3.0 kV，脫溶劑氣溫度350 ℃，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣容量600 L·h-1，采樣頻率0.1 s，間隔0.014 s，選擇離子采集模式，選擇分子離子峰的質(zhì)荷比分別為：五味子醇甲C24H32O7： [M+H-H2O]+(m/z415.212)，五味子醇乙C23H28O7：[M+H-H2O]+(m/z399.181)。

2.6 方法學考察

2.6.1線性關(guān)系

分別吸取對照品儲備液50、100、150、200、250、300 μL定容至1.0 mL，按所設UPLC-MS條件進樣2 μL，以相應的對照品的選擇離子色譜圖(見圖1，圖1用標準系列3的數(shù)據(jù)做的圖，即五味子甲素為45 μg·mL-1五味子乙素為15 μg·mL-1)中的峰面積為縱坐標，相應的對照品質(zhì)量濃度為橫坐標進行直線回歸，測定進樣質(zhì)量濃度與相應質(zhì)譜峰面積的關(guān)系,求得它們的線性方程及相關(guān)系數(shù)。以最低檢出限和定量限信噪比S/N=3和S/N=10為原則，分別計算五味子醇甲和五味子醇乙的LOD和LOQ的值。五味子醇甲和五味子醇乙的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和范圍檢出限與定量限見表1。結(jié)果表明，五味子醇甲和五味子醇乙的線性范圍好，靈敏度高。

圖1 五味子醇甲和五味子醇乙的選擇離子流色譜圖Fig 1 The SIR pictures of Schisandrin and Schisandrol B

2.6.2陰性實驗

按前述的UPLC-MS條件進樣陰性對照品溶液2 μL，在相同保留時間下的選擇離子色譜圖中未見相應五味子醇甲和五味子醇乙的峰。

2.6.3精密度與準確性

按前述的UPLC-MS條件對同一混合對照品重復測定6次，五味子醇甲和五味子醇乙的相對標準偏差(RSD，n=6)分別為1.27%和2.13%，說明本方法較為準確、可靠。

2.6.4重復性

取同一批護肝片樣品6份，各約0.200 0 g，精密稱定，制備供試品溶液，依UPLC-MS條件進行測定，測得護肝片中五味子醇甲和五味子醇乙含量平均值分別為0.807 2和0.561 0 mg·g-1，相對標準偏差(RSD，n=6)分別為3.42%和2.07%，表明重復性良好，樣品的選擇離子色譜圖見圖2。

表1 五味子醇甲和五味子醇乙標準曲線測定、LOD和LOQ檢測結(jié)果 .n=6Table 1 The results of linear regression，LOD and LOQ of Schisandrin and Schisandrol B.n=6

圖2 護肝片樣品的選擇離子流色譜圖(A、B分別為m/z415.212 和m/z399.181的選擇離子流圖)Fig 2 The SIR picture of Hugan Pian(A and B are the SIR of m/z415.212 and m/z399.181)

2.6.5穩(wěn)定性實驗

取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h按UPLC-MS條件進行測定。測得五味子醇甲和五味子醇乙的峰面積的RSD(n=8)分別為3.15%和3.73%，結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.6加標回收率實驗

精密稱定已知含量的護肝片粉末0.200 0 g共6份,按所稱量的五味子粉末中的五味子醇甲和五味子醇乙含量的80，100，120%添加對照品溶液，每種比例各配制2份，配制供試品溶液，按UPLC-MS條件進行測定?；厥章式Y(jié)果見表2，結(jié)果表明，五味子醇甲和五味子醇乙回收率良好。

表2 加樣回收率檢測結(jié)果(n=6)Table 2 The result of recovery test of the investigated compounds(n=6)

2.7 樣品含量測定

精密稱量不同批次的護肝片粉末三份配制供試品溶液，依UPLC-MS條件測定，不同批次的護肝片五味子醇甲和五味子醇乙的含量見表3。

表3 不同批次護肝片中五味子醇甲和五味子醇乙的含量 mg·g-1(n=3)Table 3 Contents of Schisandrin and Schisandrol B in Hugan Pian of three batches .mg·g-1(n=3)

3結(jié) 論

對色譜條件進行考察，包括乙腈-水和甲醇-水的不同配比和梯度洗脫，最終確定本實驗色譜條件。該條件下的五味子醇甲和五味子醇乙色譜峰峰形好，相互之間無干擾，每針色譜條件僅需5 min即可完成，具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、準確、快速等特點。

分別對不同批次的護肝片進行了五味子醇甲和五味子醇乙的含量比較，首次建立了以超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用選擇離子模式法測定這兩種木脂素的含量，為有效控制護肝片產(chǎn)品質(zhì)量提供了方法。

[1] 倪琳，楊錫.HPLC法同時測定生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素[J].中成藥，2012,34(5):872～875.

[2] 馮華，張超云等.HPLC法測定棗仁安神片中五味子醇甲的含量[J].中醫(yī)藥導報，2009,15(1)：82～83.

[3] 古海峰，張小茜等.HPLC法測定復方益肝靈片中五味子醇甲的含量[J].藥物分析雜志，2009,29(2):295～297.

DeterminationofContentsofSchisandrinandSchisandrolBinHuganPianbyUPLC-ESI-Q-TOF-MS

Wang Zhe Wang Wenbo

(Institute of Chemistry and Chemistry Engineering, Qiqihar University, Heilongjiang Qiqihar 161006)

Schisandrin and Schisandrol B were determined by UPLC-ESI-Q-TOF-MS. The linear relationship between the concentration and peak areas of the Schisandrin and Schisandrol B were all linear(r>0.999).The average recoveries(n=6) were 98.41% and 96.91%.The method was rapid，sensitive，selective and suitable for the quantitative analysis of Schisandrin and Schisandrol B in Hugan Pian.

Hugan Pian Schisandrin Schisandrol B UPLC-ESI-Q-TOF-MS

10.16597/j.cnki.issn.1002-154x.2017.05.003

2017-03-30

國家自然科學基金(81403067)；省自然科學基金(C2016059)。

王哲(1989～)，女，助理實驗師，碩士，從事天然藥物的研究，Email:zhew0316@163.com。