唐瓏 王悅芬 趙文景 孫雪艷 崔方強 孟元 趙靜 蔡朕 王暉 申子龍

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)早期的臨床表現(xiàn)以微量白蛋白尿為主，研究證明蛋白尿不僅是腎小球足細胞功能紊亂的結(jié)果，也是腎損害進展的獨立危險因素[1]。如果得不到及時有效的治療，患者很快會出現(xiàn)大量蛋白尿，并伴有腎功能進行性下降，最終進展至終末期腎衰竭，一定程度上增加了患者的病死率[2-3]。足細胞及其相關分子的損傷在糖尿病腎病早期及微量蛋白尿的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的作用，其中Nephrin、Podocin作為足細胞裂孔隔膜上的跨膜蛋白，在維持足細胞形態(tài)及腎小球濾過屏障功能中意義重大。保腎通絡方是在北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科協(xié)定處方保腎方Ⅱ號(生黃芪、生地黃、女貞子、水蛭等)加用蟲類藥(蟬蛻、地龍、全蝎)組方而成，基礎研究與臨床應用均驗證其為治療糖尿病腎病有效中藥方劑，本研究旨在通過觀察不同劑量的保腎通絡方對早期DN大鼠尿液中Nephrin、Podocin排泄的影響，初步探討保腎通絡方對早期糖尿病腎病大鼠足細胞的保護作用與最佳治療劑量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物

SPF級健康雄性SD大鼠35只，體重200～240 g，鼠齡6～8周齡，由北京市中醫(yī)研究所動物室提供(合格證書編號：11400500012601)。

保腎通絡方由生黃芪30 g、黨參15 g、生地黃30 g、女貞子20 g、菟絲子20 g、鬼箭羽15 g、三棱10 g、水蛭5 g、蟬蛻9 g、地龍6 g、全蝎6 g組成，水煎劑，4℃冰箱保存，每3天配置一次。藥材由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供；鹽酸貝那普利片，由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)(規(guī)格：10 mg×14片，國藥準字:H20030514)。

1.2 實驗試劑與儀器

鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ，美國，Sigma)；檸檬酸、檸檬酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；尿Nephrin Elisa試劑盒、尿Podocin Elisa試劑盒(北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司)等。FreeStyle?血糖儀及試紙(美國，Abbott)；低溫冰箱(美國，Thermo)；MultiSkan3酶標儀(美國，Thermo)；全自動生化分析儀(美國，Beckman Coulter)。

1.3 動物模型的建立與分組

大鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機抽取7只為空白組，其余為模型組。造模前禁食不禁水4小時，模型組單次左下腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液(以0.1 mol/L檸檬酸緩沖液冰上配置，pH 4.2～4.5)55 mg/kg，空白組注射等量的檸檬酸緩沖液。造模48小時內(nèi)給予5%葡萄糖飲水，72小時后尾尖采血，血糖儀測定隨機血糖濃度≥16.7 mmol/L且血糖水平維持一周者確定為糖尿病大鼠模型。將糖尿病模型大鼠隨機分為五組，每組7只。其中中藥組給予保腎通絡方(高劑量組20.4 mg·kg-1·d-1、中劑量組10.2 mg·kg-1·d-1、低劑量組5.1 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組及模型組給予等量蒸餾水灌胃。每日1次，連續(xù)給藥8周。

1.4 標本采集與檢測

給藥后的第8周末，血糖儀測取大鼠尾尖隨機血糖(blood glucose，BG)；所有大鼠分別放置代謝籠12小時，收集并記錄尿量，3000 r/min離心10分鐘，全自動生化分析儀測定尿糖(urine glucose，UG)。按Elisa試劑盒說明用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠尿Nephrin濃度、尿Podocin濃度、尿白蛋白濃度(urinary albumin，U-ALB)。全自動生化分析儀測定尿肌酐(urea creatinine，Ucr)；為減少尿量的影響，尿Nephrin、尿Podocin及尿白蛋白濃度均以尿肌酐校正，分別表示為UALB/Ucr(UACR)、UNE/Ucr(UNECR)、UPO/Ucr(UPOCR)；分別比較UNECR、UPOCR與UACR的相關性。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實驗期間，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)不同程度的進食及飲水量增加，尿量明顯增多，消瘦，毛色澤枯黃，活動遲緩。后期相繼出現(xiàn)白內(nèi)障、口足潰瘍等并發(fā)癥，中藥各劑量組以上情況均有不同程度的改善。

2.2 各組大鼠血糖與尿糖的比較

模型組的血糖與尿糖均高于正常組，證明造模成功；經(jīng)治療后，模型組及中藥各劑量組的血糖與尿糖水平明顯高于正常對照組(P<0.05)；與模型組比較，中藥組血糖與尿糖均有所下降，但組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血糖及尿糖比較

注： 與正常組比較，aP<0.05。

2.3 各組大鼠尿白蛋白排泄的比較

8周末，模型組及中藥組大鼠UACR明顯高于正常組(P<0.05)；各劑量中藥組UACR均較模型組有所降低(P>0.05)，其中中藥中劑量組分別低于中藥低劑量組與中藥高劑量組(P>0.05)，但中藥各劑量組組間差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.4 各組大鼠尿Nephrin、Podocin排泄的比較

8周末，模型組及中藥組大鼠UNECR及UPOCR明顯高于正常組(P<0.05)；中藥各劑量組UNECR較模型組減少，其中中藥中劑量組、中藥高劑量組較模型組明顯下降(P<0.05)，中藥中劑量組與高劑量組組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；中藥各劑量組UPOCR較模型組減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；其中中藥中劑量組UPOCR低于中藥低劑量組與中藥高劑量組，但組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.5 大鼠UNECR、UPOCR與UACR相關分析

經(jīng)Pearson相關分析，UNECR與UACR呈正相關(r=0.746，P<0.05)；UPOCR與UACR呈正相關(r=0.517，P<0.05)。見圖1、2。

表2 各組大鼠UACR、UNECR、UPOCR比較

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖1 尿Nephrin與尿微量白蛋白的相關性分析

圖2 尿Podocin與尿微量白蛋白的相關性分析

3 討論

Nephrin、Podocin是足細胞裂孔隔膜的主要跨膜蛋白，參與細胞信號傳導、調(diào)節(jié)細胞骨架重塑，在維持足細胞與腎小球濾過屏障完整性上發(fā)揮了重要的作用[4]。足細胞相互交叉的足突與隔膜裂孔共同覆蓋在腎小球基底膜的表面，維持著較大的濾過面積，是阻止蛋白滲漏入尿的最后一道屏障[5]。足細胞相關分子的異常表達已被證明與糖尿病腎損傷及蛋白尿相關[6-8]。各種原因引起的Nephrin、Podocin的損傷、移位或表達減少都會影響足細胞內(nèi)骨架蛋白重排和相連蛋白功能，導致足突變寬、融合，裂孔隔膜破壞、疏松甚至消失，最終產(chǎn)生蛋白尿。近年來，大量證據(jù)表明糖尿病腎病患者及動物模型的腎臟組織中Nephrin、Podocin表達下降，而尿中足細胞相關因子的研究也逐漸成為熱點[9]。研究證明足細胞損傷并脫落進入尿液是糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生的一個重要因素[10]。動物實驗發(fā)現(xiàn)尿Nephrin的表達可以作為腎小球損傷的早期跡象，并且常常先于蛋白尿出現(xiàn)。臨床研究亦證明尿Nephrin水平與尿蛋白呈統(tǒng)計學相關性，糖尿病患者尿Nephrin排泄明顯高于非糖尿病患者，并與足細胞損傷的嚴重程度呈正相關[8,11-12]。尿中Podocin會隨DN的進展而增加，Podocin與血肌酐呈正相關，在一定程度上反映了DN進展中蛋白尿和腎功能損害的嚴重程度[13]。Wickman等[14]通過臨床對比發(fā)現(xiàn)通過尿肌酐校正后的尿Podocin(UPOCR)表達與腎小球的損傷程度密切相關，UPOCR值會隨著蛋白尿的減少而降低，并且高UPOCR表達者往往會有較高的尿蛋白/肌酐比值，并在疾病的活動期、急性期表現(xiàn)尤為顯著。這標志著尿Nephrin、Podocin等足細胞相關分子的檢測可以作為糖尿病腎病的早期生物學標志物。

中醫(yī)古籍關于糖尿病有較多描述，《素問》首稱其為消渴病，日久兼見“肺癆”“雀盲”“癰疽”“水腫”“關格”等并發(fā)癥。其中“水腫”“尿濁”“關格”等與糖尿病腎病的表現(xiàn)尤為相近。筆者結(jié)合臨床治療經(jīng)驗與各家中醫(yī)見解，認為糖尿病日久損及腎臟，病機以氣陰兩虛為本，兼夾水濕、濁毒、瘀血等病邪，發(fā)展至糖尿病腎臟病期，腎絡瘀阻既為發(fā)病之故，又為病久之果，因此在治療上更加注重滋補腎陰，益氣活血通絡，并總結(jié)出基礎方劑保腎方Ⅱ號，由生黃芪、生地黃、丹參、女貞子、水蛭等組成，保腎通絡方是在保腎方Ⅱ號基礎上加用蟲類藥(蟬蛻、地龍、全蝎)組方而成，DN病程較長，纏綿難愈，根據(jù)中醫(yī)理論，久病入絡，久病必瘀，故DN患者往往存在腎絡瘀滯。現(xiàn)代醫(yī)學從腎臟病理角度已證實了腎絡瘀滯的存在，如腎小球硬化、間質(zhì)纖維化、腎小球及小動脈內(nèi)微血栓形成等均可認為是腎絡瘀滯的表現(xiàn)，所以很多醫(yī)家已形成共識，活血化瘀應貫穿糖尿病腎病治療的始終。而入絡成瘀，一般草木類藥物不能到達病所，唯用蟲類藥疏絡剔邪，才能松動病根，所以從腎絡瘀滯角度來看，應用蟲類藥治療DN符合其中醫(yī)病機特點。現(xiàn)代藥理研究也證實蟲類藥多具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗組胺、改善高凝狀態(tài)等作用，能針對上述因素而發(fā)揮作用。保腎通絡方以生地黃、黃芪為君藥益氣滋陰，聯(lián)合黨參、枸杞子增強養(yǎng)陰益氣之功，三棱、鬼箭羽活血化瘀，配合水蛭、蟬蛻、地龍、全蝎、蟲蟻通絡，全方攻補兼施，扶正祛邪，經(jīng)臨床及實驗研究證明療效確切[15-16]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，保腎方Ⅱ號可有效降低糖尿病腎病大鼠尿白蛋白排泄率，上調(diào)MMP-2、TIMP-2的表達，在一定程度上改善腎功能及腎臟病理的進展。臨床研究則發(fā)現(xiàn)應用保腎方Ⅱ號治療糖尿病腎病患者，可在降低蛋白尿，改善臨床癥狀的同時有穩(wěn)定血糖，減少胰島素用量的優(yōu)勢。臨床觀察同時發(fā)現(xiàn)：蟲類藥具有益腎固本、祛風散邪、清熱利濕、活血化瘀的作用，其配合健脾補腎、活血益氣藥物可明顯改善慢性腎炎患者癥狀，減少蛋白尿，安全性好[17]。

本研究通過腹腔注射鏈脲佐菌素復制糖尿病動物模型，在對比蛋白尿的同時，比較尿Nephrin、Podocin排泄，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠尿微量白蛋白、Nephrin、Podocin的排泄率均明顯增加。對早期糖尿病腎病的及時發(fā)現(xiàn)、糖尿病患者檢測指標的完善有進一步指導意義。通過不同劑量的保腎通絡方治療后，大鼠尿Nephrin的排泄率明顯低于模型組，其中中藥中劑量雖然與其他劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義，但效果呈現(xiàn)較優(yōu)趨勢，不除外低劑量藥效不夠，高劑量組濃度較高加重腎臟負擔可能。雖然UACR與UPOCR的水平與模型組相比無統(tǒng)計學差異，但是呈現(xiàn)下降趨勢，考慮治療時間較短的緣故，同時也與糖尿病腎病尿Nephrin的排泄先于白蛋白出現(xiàn)這一結(jié)論相符。相關性分析顯示UACR與UNECR、UPOCR呈正相關，推測糖尿病尿白蛋白的增加與Nephrin、Podocin蛋白從尿中丟失相關。雖然控制血糖是治療糖尿病腎病的重要手段，但以上研究提示調(diào)節(jié)Nephrin、Podocin，降低蛋白尿也可作為中藥保護腎臟的靶點之一，該保護作用可能與血糖、尿糖的降低無絕對關系。同時也為尿足細胞的測定作為糖尿病腎病生物學標志提供了有力的證據(jù)。

[1] Kawachi H, Miyauchi N, Suzuki K,et al.Role of podocyte slit diaphragm as a filtration barrier[J]. Nephrology,2006,11(4):274-281.

[2] Packham D K, Alves T P, Dwyer J P, et al. Relative Incidence of ESRD Versus Cardiovascular Mortality in Proteinuric Type 2 Diabetes and Nephropathy:Results From the DIAMETRIC (Diabetes Mellitus Treatment for Renal Insufficiency Consortium)Database[J].American Journal of Kidney Diseases,2012, 59(1):75-83.

[3] Bhattacharjee N, Barma S, Konwar N, et al. Mechanistic insight of diabetic nephropathy and its pharmacotherapeutic targets: An update[J]. European Journal of Pharmacology, 2016,791:8-24.

[4] Huang G, Lv J, Li T, et al. Notoginsenoside R1 ameliorates podocyte injury in rats with diabetic nephropathy by activating the PI3K/Akt signaling pathway[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2016, 38(4):1179-1189.

[5] Braun F, Becker J U, Brinkkoetter P T. Live or Let Die: Is There any Cell Death in Podocytes?[J]. Seminars in Nephrology, 2016, 36(3):208-219.

[6] Jha J C, Thallasbonke V, Banal C, et al. Podocyte-specific Nox4 deletion affords renoprotection in a mouse model of diabetic nephropathy[J]. Diabetologia, 2016, 59(2):379-389.

[7] Li C, Siragy H M. High glucose induces podocyte injury via enhanced (pro)renin receptor-Wnt-β-catenin-snail signaling pathway[J]. Plos One, 2014, 9(2):e89233.

[8] Kandasamy Y, Smith R, Lumbers E R, et al. Nephrin-a biomarker of early glomerular injury[J].Biomarker Research,2014,2(1):21.

[9] Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et al. Urinary Biomarkers in the Assessment of Early Diabetic Nephropathy[J]. Journal of Diabetes Research,2016，(4):1-13.

[10] Sato Y, Wharram B L, Lee S K, et al. Urine podocyte mRNAs mark progression of renal disease[J]. Journal of the American Society of Nephrology Jasn, 2009, 20(5):1041-1052.

[11] Alter M L, Kretschmer A, Von W K, et al. Early urinary and plasma biomarkers for experimental diabetic nephropathy[J].Clinical Laboratory,2012,58(7-8)：659-671.

[12] Nascimento J F D, Canani L H, Gerchman F, et al. Messenger RNA levels of podocyte-associated proteins in subjects with different degrees of glucose tolerance with or without nephropathy[J]. BMC Nephrology,2013,14(1):214.

[13] Zheng M, Lv L L, Ni J, et al. Urinary podocyte-associated mRNA profile in various stages of diabetic nephropathy[J]. Plos One,2011,6(5):20431.

[14] Wickman L, Afshinnia F, Wang S Q, et al. Urine podocyte mRNAs, proteinuria, and progression in human glomerular diseases[J]. Journal of the American Society of Nephrology Jasn, 2013, 24(12):2081.

[15] 段昱方,蔡朕，趙文景,等.改良保腎方Ⅱ號治療糖尿病腎病臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2011,13(6):66-68.

[16] 蔡朕,鄭桂敏,劉寶利，等.保腎通絡方對糖尿病腎病大鼠腎臟病理和腎組織MMP-2/TIMP-2表達的影響[J].北京中醫(yī)藥,2010,6(29):452-455.

[17] 趙文景,張炳厚,劉寶利，等.加味補腎利濕湯配合蟲類藥治療慢性腎炎蛋白尿的臨床觀察[J].北京中醫(yī)藥,2014,3(33):179-183.