張華林 李夢璐 黃 金 王凱戎 馬海絨

（寧夏醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川750004）

電紡PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架的制備及性能研究

張華林 李夢璐 黃 金 王凱戎 馬海絨

（寧夏醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川750004）

目的 通過高壓靜電紡絲法制備PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架并對其理化性能、細(xì)胞相容性進(jìn)行表征。方法先將聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）與羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、羊毛角蛋白復(fù)合，采用高壓靜電紡絲法制備PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架，采用掃描電子顯微鏡（SEM）、紅外光譜（FTIR）、萬能力學(xué)測試機(jī)以及細(xì)胞培養(yǎng)等分析復(fù)合支架的理化性能及細(xì)胞相容性。結(jié)果 PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架是由長而連續(xù)的超細(xì)纖維相互交織構(gòu)成的三維多孔結(jié)構(gòu)，HA、羊毛角蛋白顆?；径急话诶w維內(nèi)部；PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率和楊氏模量的平均值分別為4.16MPa、13.96%和135.55MPa；SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PLGA/MWNTs/羊毛角蛋白復(fù)合支架表面生長、增殖良好，HA和羊毛角蛋白的加入有利于細(xì)胞的粘附和生長。結(jié)論 通過高壓靜電紡絲法制得的PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架具有良好的表面形貌、力學(xué)性能和細(xì)胞相容性，在組織工程領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力，尤其是作為組織工程的支架用于組織再生。

靜電紡絲；PLGA/HA/羊毛角蛋白；復(fù)合支架；細(xì)胞相容性

嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染、先天性畸形等所造成骨缺損的治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的難題和巨大挑戰(zhàn)。目前臨床上常用的修復(fù)手段有自體骨移植、異體骨移植以及使用人工骨等，但以上方法均存在一定缺陷。因此，有必要尋找一種新的骨缺損的修復(fù)手段。

組織工程學(xué)的興起和發(fā)展，為彌補(bǔ)目前骨缺損治療方法的缺陷帶來了希望[1]。組織工程支架是骨組織工程的核心環(huán)節(jié)之一。目前骨組織工程支架材料包括無機(jī)材料和有機(jī)材料兩大類。但由于有機(jī)、無機(jī)的單一材料都存在一些不足，很難滿足理想的骨組織工程支架所要求的特性，所以可以通過合適的方法將幾種單一材料復(fù)合，形成復(fù)合型材料，取長補(bǔ)短，以解決理想的骨支架的問題[2]。高壓靜電紡絲，是一種利用聚合物溶液或熔體在強(qiáng)電場作用下形成噴射流進(jìn)行紡絲加工的工藝[3]。由靜電紡絲制備出的納米纖維由于具有小尺寸、大比表面積和特殊的表面與界面效應(yīng)，從而表現(xiàn)出傳統(tǒng)纖維材料所不具備的獨特性能。通過靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維材料，廣泛應(yīng)用于軟骨、骨、皮膚、血管、神經(jīng)等組織工程和修復(fù)再生方面[4-5]。

本研究將合成材料聚乙交酯-丙交酯共聚物（PLGA）、天然成分羊毛角蛋白和無機(jī)成分羥基磷灰石（HA）復(fù)合在一起形成復(fù)合材料，優(yōu)勢互補(bǔ)，通過高壓靜電紡絲法構(gòu)建PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合骨組織工程支架，并對其理化性能、細(xì)胞相容性進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 電紡PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架的制備：

將PLGA溶于三氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中，濃度為15%w/v，待PLGA充分溶解后再加入5%w/v的HA以及5%w/v的羊毛角蛋白，室溫下攪拌30 min后超聲震蕩60 min。將紡絲液倒入10 mL注射器中，將注射器與電紡設(shè)備相連接進(jìn)行靜電紡絲。

1.2 PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架的表征：用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察膜的表面形貌；用傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）分析復(fù)合膜在4000～500 cm-1區(qū)間的紅外光譜圖；用萬能力學(xué)測試機(jī)測試復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度、彈性模量以及斷裂伸長率。將復(fù)合膜制成10 mm×70 mm的長條形試樣進(jìn)行拉伸測試，每一組試樣的數(shù)量為5個，拉力機(jī)的拉伸速度為5 mm/min。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、接種：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被置于含5 mL的α-MEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37℃含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。將消毒后的支架放入6孔板中，第三代細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶溶液消化后，將濃度為1×105個/mL的細(xì)胞懸液常規(guī)接種于支架表面，進(jìn)行SEM觀察。

1.4 細(xì)胞增殖情況測定：將實驗組（PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架、PLGA/HA復(fù)合支架）和對照組（純PLGA支架）的樣品置于6孔板內(nèi)，加入α–MEM培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)的細(xì)胞以1×105個/mL的密度接種于放有試樣的培養(yǎng)板內(nèi)，分別在第1，3，5天測定各孔吸光度值，記錄結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，組間兩兩比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)間采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1純PLGA支架、PLGA/HA復(fù)合支架及PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架的SEM圖（3000×）。

2 結(jié)果

2.1 PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架的SEM觀察：三組都通過靜電紡絲的方法成功制備了長而連續(xù)的電紡纖維，三組支架均由超細(xì)纖維相互交織構(gòu)成三維多孔結(jié)構(gòu)，與天然的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似。純PLGA支架纖維表面光滑、直徑均勻；PLGA/HA復(fù)合支架纖維表面略粗糙，纖維局部可以看到團(tuán)聚的HA顆粒，直徑?jīng)]有純PLGA纖維均勻；PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架纖維直徑明顯較純PLGA纖維小，纖維粗細(xì)不均，HA、羊毛角蛋白顆?；径急话诶w維內(nèi)部，纖維局部可以看到團(tuán)聚的HA和羊毛角蛋白顆粒，見圖1。

2.2 PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架的紅外光譜分析：HA納米顆粒的紅外光譜圖顯示了在1090cm-1，603cm-1和 566 cm-1處的PO43-吸收峰以及3500 cm-1附近的OH吸收峰。羊毛角蛋白在3424.14 cm-1處為氨基和羧基的伸縮振動峰，在1648.77 cm-1、1539.50 cm-1、1241.60 cm-1處均有強(qiáng)吸收峰，分別為α-螺旋構(gòu)象的酰胺I譜帶、酰胺Ⅱ譜帶和酰胺Ⅲ譜帶的特征峰，說明羊毛角蛋白中含有大量的α-螺旋型構(gòu)象，而且含有酰胺鍵，并且有多肽特征，是以α-螺旋型構(gòu)象為主的蛋白質(zhì)。PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架、PLGA/HA復(fù)合支架與純PLGA支架的紅外光譜圖很相似，并沒有出現(xiàn)HA以及羊毛角蛋白的特征峰，分析原因可能是由于復(fù)合支架中HA、羊毛角蛋白顆粒含量很少以及二者被包裹于纖維內(nèi)部的原因，見圖2。

圖2 紅外光譜圖

2.3 PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架的力學(xué)性能分析：PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率和楊氏模量的平均值分別為4.16 MPa，13.96%和135.55 MPa，表明所制備的PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架具有一定的強(qiáng)度和柔韌性，能夠滿足支架材料的力學(xué)性能要求，詳見表1。

表1 PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架、PLGA/HA復(fù)合支架以及純PLGA支架的的力學(xué)性能指標(biāo) （x±s）

圖3 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的SEM圖

2.4 細(xì)胞與復(fù)合支架共培養(yǎng)SEM觀察：培養(yǎng)24h后，在純PLGA支架表面，粘附細(xì)胞數(shù)量較少，大部分細(xì)胞胞體呈細(xì)長梭形，面積較小，表明細(xì)胞尚未發(fā)生鋪展，少部分細(xì)胞己經(jīng)鋪展呈多邊形。在PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架和PLGA/HA復(fù)合支架表面，細(xì)胞數(shù)量明顯較純PLGA組多，細(xì)胞己經(jīng)開始鋪展，呈多突起狀借偽足附著于材料表面，見圖3。

2.5 細(xì)胞的增殖活性：三組細(xì)胞的數(shù)量都隨培養(yǎng)時間的增加而增加。PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架組的細(xì)胞數(shù)量較PLGA/HA復(fù)合支架組多（P＜0.05）。說明實驗組細(xì)胞增殖的速度和活性明顯高于對照組，PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架組高于PLGA/HA復(fù)合支架組。這可能是因為實驗組加入的HA和羊毛角蛋白增加了復(fù)合膜的親水性和生物活性，因此，也促進(jìn)了SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期的粘附和增殖，見圖4。

3 討論

本研究通過高壓靜電紡絲法制備得到PLGA/HA/羊毛角蛋白復(fù)合支架。該復(fù)合支架具有良好的表面形貌、力學(xué)性能和細(xì)胞相容性，在組織工程領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力，尤其是作為組織工程的支架用于組織再生。

圖4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MTT圖

［1］ Langer R，Vacanti JP.Tissue Engineering［J］.Science，1993，260（2）：920-926.

［2］ Zhang HL，Chen ZQ.Fabrication and ccharacterization of electrospun PLGA/MWNTs/hydroxyapatite biocomposite scaffolds for bone tissue engineering［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2010，25（2）：241-259.

［3］ 張文.PPV和PPV/PVA電紡纖維的研制與性能研究［D］.沈陽：東北大學(xué)，2006.

［4］ Spasova M，Stoilova O，Manolova I，et al.Preparation of PLLA/PEG nanofibers by electrospinning and potential applications ［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2007，22（3）：62-76.

［5］ Piras AM，Chiellini F，Chiellini E，et al.New multicomponent bioerodible electrospun nanofibers for dual-controlled drug release［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2008，23（6）：423-443.

Study on Preparation and Properties of Electrospun PLGA/HA/wool keratin Composite Scaffold

Zhang Hualin Li Menglu Huang Jin Wang Kairong Ma Hairong
（College of Stomatology，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

Objective To prepare the PLGA/HA/wool keratin composite scaffold by electrospinningand study its physical and chemical properties and cell biocompatibility.Methods The PLGA/HA/wool keratin composite scaffoldwas prepared by electrospinning；then，SEM，F(xiàn)TIR，universal mechanical testing machine and cell culture were used for characterization.Results The PLGA/HA/wool keratin composite scaffold，composed of long and continuous superfine fibers，had a three-dimensional and porous structure.HA and wool keratin particles were wrapped inside the fibers；SD rat bone marrow mesenchymal stem cells grew well on the surface of PLGA/HA/wool keratin composite scaffold，and the addition of HA and wool keratin was beneficial to cell adhesion and growth.Conclusion The electrospun PLGA/HA/wool keratin composite scaffold has good surface morphology，mechanical properties and biocompatibility，and it may have great potential applications in the field of tissue engineering，especially as a scaffoldfor tissue regeneration.

Electrospinning；PLGA/HA/wool keratin；Composite scaffold；Cell compatibility

R783.1

A 學(xué)科分類代碼： 32044

1001-8131（2017）06-0501-04

寧夏自然科學(xué)基金項目資助N217073；大學(xué)生創(chuàng)新實驗項目（寧教高（2013）254號）

2017-05-18