周志敏,何群力

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室,新鄉(xiāng) 453000; 2.許昌市人民醫(yī)院，許昌 461000)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae,S.pn)是臨床較常見的機(jī)會性致病菌,定植于鼻咽部。侵襲性肺炎球菌疾病(Invasive pneumococcal disease,IPD)是引起肺炎、菌血癥和腦膜炎等的重要菌種,臨床檢出率約為30%～60%,致死率約為5%～16%,是10歲以下兒童細(xì)菌感染死亡的主要原因[1]。隨著耐萬古霉素和大環(huán)內(nèi)酯類的肺炎鏈球菌的出現(xiàn)[2-3],給抗生素治療帶來了嚴(yán)峻考驗(yàn)。研究認(rèn)為[4],菌株的侵襲力和致病力是由遺傳和環(huán)境2個因素共同決定。不同地區(qū)或同一地區(qū)不同時期流行的IPD可能不同[5-6]?；诖?本研究旨在分析許昌市人民醫(yī)院(以下簡稱我院)分離的IPD流行血清基因型、致病毒力基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥機(jī)制及與細(xì)菌毒力的關(guān)系,為細(xì)菌疫苗的研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 Stepone PCR 儀和凝膠圖像分析儀(美國ABI公司)；SYDRASYS 2電泳儀(法國Sebia公司)；BSC-1100-1-LIIA2生物安全柜(北京哈東聯(lián)公司)；HF151UV細(xì)菌培養(yǎng)箱(上海力康公司)。

1.2材料 基因組 DNA 提取試劑盒(日本TaKaRa 公司)；PCR擴(kuò)增體系(美國Sigma 公司)；引物(上海生工生物工程有限公司)。

2 對象與方法

2.1對象 收集2013年6月～2016年6月分離鑒定的侵襲性肺炎鏈球菌(IPD)共12株，作為觀察組,同時收集10株健康志愿者的攜帶肺炎鏈球菌作為對照組。采用Phoenix100全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)(美國BD 公司)進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定。觀察組男性7例,女性5例,年齡為6～62歲,中位年齡為12歲。標(biāo)本來自血液6例,痰液2例,胸水2例,腦脊液2例。對照組男性5例,女性5例,年齡為5～60歲,中位年齡為10歲,標(biāo)本來自咽拭子。2組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。該研究取得我院倫理委員會批準(zhǔn)及患者、家屬的知情同意權(quán)。

2.2研究方法 采用多重PCR擴(kuò)增法進(jìn)行血清基因型分型,PCR 擴(kuò)增6個致病毒力基因,包括莢膜(cps2A)、細(xì)菌素(bacteriocin)、表面黏附素 A (psa A)、B 組鏈球菌細(xì)胞壁分離蛋白(pcs B)、溶血素(ply)和酪蛋白水解蛋白酶 P(clp P),分析其堿基序列的突變情況；采用 MIC 法測定青霉素、頭孢吡肟、左氧氟沙星、紅霉素和美羅培南的耐藥性和最低抑菌濃度(MIC)值。

2.2.1血清基因型分型 主要步驟：采用C+Y半合成培養(yǎng)基(主要成分有酪蛋白、谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸、腺苷、膽堿和酵母等)培養(yǎng)肺炎鏈球菌菌株至 A620為 0.4～0.5,提取基因組 DNA,多重 PCR法對流行的6種血清型進(jìn)行分型。引物見表1。反應(yīng)體系為10×Buffer 5.0 μL+MgCl22.5 μL+d NTP mixture 2.0 μL+上下游引物各1.0 μL+Taq 酶0.4 μL+DNA 模板0.5 μL,加水至總體積25 μL。反應(yīng)參數(shù)為94 ℃,4 min；94 ℃,45 s；54 ℃,45 s；65 ℃,2 min 30 s,共循環(huán) 30 次。反應(yīng)完成后,取 4 μL 產(chǎn)物，用 2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶。

表16種血清型的序列引物和長度

Tab.1 Sequence and length of 6 serotypes

血清型引物長度/bp6CF:5'-CATTTTAGTGAAGTTGGCGGTGGAGTT-3'727R:5'-AGCTTCGAAGCCCATACTCTTCAATTA-3'6A/BF:5'-AATTTGTATTTTATTCATGCCTATATCTGG-3'250R:5'-TTAGCGGAGATAATTTAAAATGATGACTA-3'14F:5'-CTTGGCGCAGGTGTCAGAATTCCCTCTAC-3'208R:5'-GCCAAAATACTGACAAAGCTAGAATATAGCC-3'17FF:5'-TTCGTGATGATAATTCCAATGATCAAACAAGAG-3'693R:5'-GATGTAACAAATTTGTAGCGACTAAGGTCTGC-3'19AF:5'-GTTAGTCCTGTTTTAGATTTATTTGGTGATGT-3'478R:5'-GAGCAGTCAATAAGATGAGACGATAGTTAG-3'19FF:5'-GTTAAGATTGCTGATCGATTAATTGATATCC-3'304R:5'-GTAATATGTCTTTAGGGCGTTTATGGCGATAG-3'

2.2.2致病毒力基因檢測 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎鏈球菌 D39設(shè)計(jì)毒力基因引物序列,反應(yīng)體系見表2,為5×PS Buffer 10.0 μL+ d NTP mixture 4 μL+上下游引物各1.0 μL+ Primer Star 0.5 μL+ DNA模板1.0 μL，加水至50 μL。反應(yīng)參數(shù)為98 ℃,10 s；53 ℃,30 s；72 ℃,1 min,循環(huán) 30 次,72 ℃,10 min。反應(yīng)完成后,取 3 μL產(chǎn)物，用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶,序列分析采用DNAssist Version 2.2 軟件。

表2毒力基因的序列引物和長度

Tab.2 Sequence and length of virulence genes

毒力基因引物長度/bpcps2AF:5'-TTCGCGGGAAGTCTACTAAG-3'1606R:5'-GGGACCGTCATCTACATCAA-3'bacteriocinF:5'-AAGAGTAAGTTCGTTGTT-3'577R:5'-TCTACAGTCTTTCCCATT-3'psaAF:5'-TAATGTTGCGGCAGGTTCT-3'1136R:5'-CGGAAATGTGGGCATAGAA-3'pcsBF:5'-ACGGTAAAACCTGAAAAGAG-3'1305R:5'-AAATGTAACAAAGGCGTAAT-3'plyF:5'-ATGGCAAATAAAGCAGTAAATGACT-3'1415R:5'-CTAGTCATTTTCTACCTTATCCTCT-3'clpPF:5'-AACTCAAAAGGAGAAATG-3'791R:5'-TCTTGGAATGATAGGTAAT-3'

2.2.3藥敏試驗(yàn) 質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619,采用全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn),2013CLSI 肺炎鏈球菌 MIC 法標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果分析。

3 結(jié)果

3.1血清基因型分型 基因型14、6A/6B和19F在2組中檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),19A、6C和17F在觀察組中檢出率顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

3.2致病毒力基因 觀察組6種致病毒力基因檢出率均明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

3.3藥敏試驗(yàn) 觀察組對青霉素和紅霉素不敏感率顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組對頭孢吡肟、左氧氟沙星和美羅培南的敏感率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組對青霉素和紅霉素的MIC值顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表3血清基因型分型

Tab.3 Classification of serum genotype [例(%)]

表4致病毒力基因

Tab.4 Virulence genes [例(%)]

表5藥敏試驗(yàn)檢測耐藥率和MIC值

Tab.5 Drug sensitivity test detected drug resistance and MIC

組別例數(shù)青霉素紅霉素頭孢吡肟左氧氟沙星美羅培南青霉素MIC/μg·mL-1紅霉素MIC/μg·mL-1觀察組1211(91.7)10(83.3)2(16.7)2(16.7)1(8.3)1.52±0.661.43±0.75對照組101(10.0)2(20.0)1(10.0)1(10.0)1(10.0)0.42±0.160.44±0.18P0.0000.0081.0001.0001.0000.0000.000

4 討論

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[7-8],我國肺炎鏈球菌以19A、19F、3和14血清型多見,但不同地區(qū)、不同時期的流行菌株可能不同。不同血清型的致病毒力基因和敏感抗生素種類也不同[9-10]。

通過該研究得出,IPD和攜帶肺炎鏈球菌中血清基因型14、6A/6B和19F檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,19A、6C和17F在IPD中檢出率顯著升高。提示19A、6C和17F基因型更具有侵襲性。檢測IPD的6種致病毒力基因均明顯高于對照組,對青霉素和紅霉素不敏感率顯著增加,對頭孢吡肟、左氧氟沙星和美羅培南的敏感率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

高效疫苗對預(yù)防IPD的發(fā)生有重要臨床價值[11]。肺炎鏈球菌疫苗有23 價多糖疫苗(PPV23)和莢膜多糖結(jié)合疫苗(PCV),PPV23 包含絕大多數(shù)的致病血清型,但無法誘導(dǎo) T 細(xì)胞免疫反應(yīng),對2歲以下幼兒保護(hù)效果差[12]；PCV對嬰幼兒有效,但僅包含7、10、11和 13價血清型[13]。13價對19A 血清型莢膜多糖抗原有較高的結(jié)合作用[14]。有研究提出[15-16],檢測肺炎鏈球菌血清型的多位點(diǎn)序列(ST)對評估致病毒力基因的保守性,尋找更加有針對性的疫苗有重要應(yīng)用價值。

綜上所述,我院分離的IPD血清型主要有19A、6C和17F,共有6種致病毒力基因,對青霉素和紅霉素耐藥,針對不同血清型和致病毒力基因進(jìn)行合理的疫苗和抗生素應(yīng)用,對提高臨床抗菌效果、減少耐藥性產(chǎn)生有重要意義。

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