劉小莉， 張金振， 胡彥新， 劉 源， 周劍忠

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

河蟹營養(yǎng)豐富，味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，特別是蟹黃中含有豐富的脂肪與蛋白質(zhì)，可用于制作各種美味菜肴。因此，近年來河蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，成為特種水產(chǎn)品中最具代表性和最有影響力的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)[1]。

但河蟹的生產(chǎn)季節(jié)性非常強(qiáng)，有研究表明，蟹黃的風(fēng)味在10月份左右達(dá)到最佳，脂肪酸的含量在11月份左右達(dá)到最大值，具有最佳食用價值。在河蟹集中上市的季節(jié)，市場不能及時消化掉的大量的積壓鮮活蟹及殘次蟹一旦失去食用價值，也將造成很大的浪費(fèi)[2]。目前，國內(nèi)少數(shù)小型水產(chǎn)加工企業(yè)將鮮銷剩余的斷足螃蟹或小規(guī)格蟹經(jīng)洗凈、蒸煮，人工掏出蟹黃、蟹肉，包裝、速凍后出售。越來越多的研究表明，冷凍水產(chǎn)品的貨架期較長，可以有效抑制微生物和酶的作用，但即使在低溫下，水產(chǎn)類脂質(zhì)中含有的大量高度不飽和脂肪酸及蛋白質(zhì)也會發(fā)生氧化或分解變質(zhì)，改變水產(chǎn)品的組織、色澤、水合能力、風(fēng)味等一系列特性，對其保存、銷售和食用產(chǎn)生不良影響[3-4]。與蟹肉相比，蟹黃中含有更豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，因此在冷凍儲藏過程中更易發(fā)生一系列影響品質(zhì)的生化特性的改變。

茶多酚作為一種天然抗氧化劑，具有天然、高效、低毒的特點(diǎn)，能有效抑制脂質(zhì)氧化，防止油脂哈敗，并能在一定程度上抑制蛋白質(zhì)的氧化變性，是化學(xué)合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯(BHT)的有效替代物質(zhì)。本研究采用茶多酚作為抗氧化劑，并以BHT作為陽性對照，考察在凍藏期間蟹黃蛋白質(zhì)、脂肪氧化相關(guān)指標(biāo)的變化，篩選合適的抗氧化劑，以期為工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)，提高凍藏產(chǎn)品的品質(zhì)，為蟹黃進(jìn)一步的加工利用提供原料保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑 鮮活河蟹，購自南京市玄武區(qū)孝陵衛(wèi)菜市場，體質(zhì)量(150±15)g，經(jīng)江蘇省淡水水產(chǎn)研究所鑒定為中華絨螯蟹(EriocheirsinensisH. Milne-Edwards)。

丙二醛(MDA)測定試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)法蛋白定量測試盒，均購自南京建成生物工程研究所；5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5，5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]、8-苯胺基-1-奈磺酸銨(1-anilino-napthalene-8-sulfonic acid，ANS)，均購自Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 低溫試驗(yàn)箱，購自南京泰斯特試驗(yàn)設(shè)備有限公司；醫(yī)用低溫保存箱，購自海爾集團(tuán)；多功能酶標(biāo)儀，購自美國BioTek儀器有限公司；高速勻漿機(jī)，購自德國IKA；pH計，購自上海雷磁儀器廠；蟹黃吸附機(jī)，購自山東省諸城市興和機(jī)械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蟹黃采集和預(yù)處理 采用蟹黃吸附機(jī)通過真空吸附的方式采集新鮮河蟹的蟹黃，分別加入不同種類、不同終濃度的抗氧化劑?？寡趸瘎┌ńK濃度為0.1、0.2 g/kg的BHT和終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 g/kg的茶多酚，另外以不添加任何抗氧化劑的蟹黃作為對照，-20 ℃速凍后凍藏待用。

1.2.2 蟹黃油脂的提取 稱取蟹黃樣品，4 ℃解凍。加入10倍體積的石油醚(沸程60～90 ℃)，超聲波處理40～60 min，靜置分層，收集上層有機(jī)溶劑相，下層水相樣品再加入石油醚重復(fù)提取2次，合并有機(jī)相，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干有機(jī)溶劑，得到蟹黃油脂粗提物。

1.2.3 過氧化值的測定 取“1.2.2”節(jié)中提取的蟹黃油脂粗提物，按照GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[5]中過氧化值第二法測定過氧化值。

1.2.4 丙二醛含量的測定 稱取一定量的蟹黃樣品，加入5倍體積去離子水，10 000 r/min勻漿1 min，用于丙二醛含量的檢測。依據(jù)硫代巴比妥酸(TBA)法原理采用試劑盒檢測，結(jié)果以1 mg樣品蛋白質(zhì)中丙二醛的含量(nmol/mg)表示。

1.2.5 肌原纖維蛋白的提取 參照Yang等的方法[6]提取肌原纖維蛋白。向10 g蟹肉樣品中加入20 mL、4 ℃預(yù)冷的去離子水，12 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min、4 ℃離心 20 min，棄去上清液，沉淀中加入去離子水，再重復(fù)提取1次。沉淀中再加入20 mL、4 ℃預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)(其中補(bǔ)充0.6 mol/L NaCl)，12 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液。沉淀用上述含有NaCl的磷酸緩沖液再重復(fù)提取1次，合并上清液。蛋白質(zhì)含量采用BCA試劑盒測定。

1.2.6 總巰基含量的測定 參考Benjakul等的方法[7]測定總巰基的含量。調(diào)節(jié)“1.2.5”節(jié)中提取的肌原纖維蛋白溶液濃度至4 mg/mL，取0.5 mL加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl buffer[pH值為6.8，含有8 mol/L尿素、2%十二烷基磺酸鈉(SDS)、10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]。取1 mL上述混合液，加入0.1 mL 0.1% DTNB，40 ℃溫育25 min，測定其D412 nm?？瞻讓φ找?.6 mol/L KCl溶液(pH值7.0)代替樣品?？値€基含量的計算公式如下：

總巰基含量(nmol/mg)=[(D×n)/(ε×ρ)]×106

式中：D為412 nm波長處的吸光度；n為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾吸光系數(shù)，取值為13 600 L/(mol·cm)；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.7 蛋白表面疏水性的測定 用ANS作為熒光探針測定表面疏水性[7]。用10 mmol/L磷酸緩沖液(pH值6.0，含 0.6 mol/L NaCl)將提取的肌原纖維蛋白溶液稀釋至不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL)，取4 mL各濃度的肌原纖維蛋白溶液，與30 μL ANS(用0.1 mol/L、pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液溶解，濃度為8 mmol/L)混合。測定ANS-蛋白結(jié)合體的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長374 nm、發(fā)射波長485 nm。以熒光強(qiáng)度對肌原纖維蛋白濃度做圖，所得到的曲線斜率即為蛋白表面疏水性指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍藏期間蟹黃蛋白總巰基含量的變化

生物體內(nèi)蛋白質(zhì)巰基的含量非常豐富，且對氧化反應(yīng)比較敏感[8]。在凍藏加工過程中，由于凍結(jié)處理時冰晶的形成，以及儲藏期間溫度波動造成的冰晶大小反復(fù)改變，使肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使埋藏在分子內(nèi)部的疏基活性基團(tuán)暴露出來，進(jìn)而被氧化成二硫鍵，導(dǎo)致疏基含量減少。巰基的含量可以用于表征蛋白質(zhì)氧化的程度[9]。由圖1可知，6個月的凍藏期內(nèi)，各個處理的蟹黃中蛋白總巰基含量均呈減少趨勢，且2～3個月后下降幅度更大，其中對照組的下降趨勢最為明顯，添加抗氧化劑組的下降速度比對照組緩慢，且最終總巰基的含量均高于對照組。BHT抑制總巰基下降的作用顯著(P<0.05)，且所采用的2種不同濃度之間的作用差異不顯著。而添加茶多酚的4組樣品中，使用量為0.2、0.3、0.4 g/kg的處理效果顯著增強(qiáng)(P<0.05)，隨著使用量的增加變化不顯著，6個月儲藏期結(jié)束后，0.3、0.4 g/kg處理組的總巰基含量低于0.2 g/kg處理組。茶多酚是目前普遍使用的1種天然高效低毒的抗氧化物質(zhì)，是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，其抗氧化機(jī)制主要有直接清除自由基、作用于與自由基有關(guān)的酶、絡(luò)合金屬離子、再生高效抗氧化劑等，可用于多種食品的保鮮儲藏[10-11]。本研究中茶多酚的抗氧化效果為非濃度依賴型，這可能是由于茶多酚在儲藏過程中發(fā)生自身氧化，其產(chǎn)物影響抗氧化的效果。

2.2 凍藏期間蟹黃蛋白表面疏水性指數(shù)的變化

蛋白質(zhì)表面疏水性可以反映蛋白質(zhì)的變性程度。蛋白質(zhì)溶解在水溶液中時，由于氨基酸殘基的極性不同，疏水作用力傾向于將疏水性氨基酸包裹于內(nèi)部，只有少量疏水性氨基酸能暴露于蛋白表面。在凍藏過程中，蛋白變性，其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，部分疏水殘基暴露，并隨著凍藏時間的延長及凍藏過程中溫度的波動，疏水殘基暴露的數(shù)量增多，表面疏水性增大[12-13]。由圖2可知，BHT的作用效果表現(xiàn)出顯著的濃度依賴型，0.2 g/kg BHT抑制蟹黃蛋白表面疏水性指數(shù)增加的效果顯著高于0.1 g/kg BHT(P<0.05)。茶多酚的作用效果與濃度之間的依賴關(guān)系沒有BHT明顯，0.1 g/kg茶多酚的作用效果與0.1 g/kg BHT相當(dāng)，隨著濃度的增加，茶多酚對蛋白表面疏水性的抑制效果增強(qiáng)，0.3 g/kg茶多酚作用下蟹黃蛋白表面疏水性指數(shù)的增加幅度最小，但隨著茶多酚用量的繼續(xù)增加，蟹黃蛋白表面疏水性指數(shù)的增加趨勢反而增強(qiáng)。但即使在茶多酚的最佳作用條件下(0.3 g/kg茶多酚)，其作用效果也不及0.2 g/kg BHT。

2.3 凍藏期間蟹黃過氧化值的變化

河蟹蟹黃的脂含量較高，且與品種、喂養(yǎng)方式、溫度、氣候條件等因素密切相關(guān)，湯辰婧等測定了不同階段中華絨螯蟹的脂含量為6.85%～14.35%[14]。在長期的凍藏過程中，油脂也會發(fā)生緩慢的氧化[4]。油脂初始氧化的產(chǎn)物是過氧化物，過氧化物易分解產(chǎn)生醛、酮等小分子有害化合物，常以過氧化物在油脂中的產(chǎn)生作為油脂氧化酸敗的開端。

由圖3可知，2個月后蟹黃過氧化值(POV)迅速增加，與蛋白總巰基含量的變化趨勢類似。添加抗氧化劑處理對蟹黃POV增加的抑制作用顯著(P<0.05)，0.2 g/kg BHT的抑制效果最好，茶多酚在低濃度(0.1 g/kg)條件下作用效果不明顯，隨著濃度的增加，抑制作用顯著增強(qiáng)(P<0.05)，0.2 g/kg茶多酚與0.1 g/kg BHT對蟹黃POV增加的抑制作用相當(dāng)，0.3、0.4 g/kg 茶多酚對蟹黃POV增加的抑制作用效果顯著低于0.2 g/kg BHT(P<0.05)。在6個月凍藏期內(nèi)，各個處理組的蟹黃POV均低于9 meq/kg。武華等研究不同凍藏溫度對鳙魚片脂質(zhì)特性變化的影響，發(fā)現(xiàn)不同凍藏溫度下魚片的過氧化值均在第4周達(dá)到最大值，-10 ℃組的過氧化值最高達(dá)25.48 μmol/kg，-30 ℃組的過氧化值僅為 10.01 μmol/kg，而后隨著凍藏時間的延長，作為初級脂肪氧化產(chǎn)物的過氧化物逐漸降解[15]。不同研究中出現(xiàn)的POV不同變化趨勢與所測定樣品中飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸及其他組成有關(guān)。

2.4 凍藏期間蟹黃中丙二醛含量的變化

丙二醛是常用的脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，測定值反映了脂肪二級氧化產(chǎn)物即最終生成物的含量[16]。由圖4可知，抗氧化劑的使用有效抑制了蟹黃中丙二醛的生成，對照組在凍藏3個月時MDA含量達(dá)到最大值，隨后又進(jìn)一步降解導(dǎo)致MDA含量下降。與蛋白質(zhì)氧化和過氧化值增加不同的是，0.2 g/kg茶多酚表現(xiàn)出最強(qiáng)的延緩丙二醛含量增加的作用，效果顯著優(yōu)于0.2 g/kg BHT(P<0.05)，隨著茶多酚使用量的進(jìn)一步提高，其延緩丙二醛含量增加的作用反而下降，與0.2 g/kg BHT的作用效果相當(dāng)。

3 結(jié)論

凍藏是水產(chǎn)品運(yùn)輸、儲藏中常見的方法之一。相對于其他保藏方式，凍藏能更大限度地保持產(chǎn)品的品質(zhì)，延長保質(zhì)期。但冷凍處理可以將水產(chǎn)品體內(nèi)大部分水分凍結(jié)成冰晶，體積增大，產(chǎn)生內(nèi)壓，且細(xì)胞介質(zhì)中離子強(qiáng)度增大，引起脂肪和蛋白質(zhì)的氧化，另外在長期凍藏過程中，由于溫度波動，產(chǎn)品常常會經(jīng)過反復(fù)解凍、凍結(jié)的過程造成機(jī)械損傷，破壞肌肉結(jié)構(gòu)，加速蛋白和脂肪的氧化，造成其營養(yǎng)缺失、風(fēng)味劣變。

本試驗(yàn)通過對蟹黃進(jìn)行不同的抗氧化處理，測定每組樣品在凍藏過程中蛋白和脂肪氧化相關(guān)指標(biāo)的變化情況， 發(fā)現(xiàn)隨著凍藏時間的延長，蟹黃蛋白的總巰基含量呈下降趨勢，表面疏水性、過氧化值、丙二醛含量呈上升趨勢?？寡趸瘎┑氖褂脤ρ泳徤鲜龅鞍踪|(zhì)和脂肪氧化指標(biāo)的變化有明顯的作用，且除丙二醛含量外，高濃度的BHT對其他蛋白質(zhì)和脂肪劣變指標(biāo)的變化表現(xiàn)出了較強(qiáng)的延緩作用。綜合而言，不同濃度的茶多酚中，0.2 g/kg茶多酚的使用量對各項(xiàng)指標(biāo)的變化均有較好的抑制效果，可代替人工合成抗氧化劑BHT，有效減緩凍藏過程中蟹黃蛋白和脂肪的氧化進(jìn)程。

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