趙莎莎， 袁華根

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類的常見污染物，主要來源于煤、石油等燃燒產(chǎn)生的煙氣、尾氣以及焦化煉油等工業(yè)廢水中，具有致癌、致畸和致突變型特性。在水環(huán)境中通過重點監(jiān)測，PAHs在體內(nèi)代謝時通過自身或中間代謝物氧化產(chǎn)生大量活性氧自由基[1]，進而產(chǎn)生DNA斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶失活等毒性反應(yīng)[2]。苯并芘由于其性質(zhì)穩(wěn)定、致癌性性強所以是PAHs的典型代表[3]。一些研究表明，苯并芘是高活性致癌劑，而并不是直接的致癌物，必須與細胞微粒體中的混合功能氧化酶相互作用才具有致癌性。隨著苯并芘濃度的增加，癌癥的發(fā)生率也會明顯提高，且腫瘤的潛伏期也會明顯縮短，苯并芘不僅會引發(fā)動物產(chǎn)生癌癥而且還會導(dǎo)致子代發(fā)生腫瘤癌變，不但會造成動物免疫功能下降，而且也會造成胚胎畸形甚至死亡[4-9]。

魚類體內(nèi)抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)。其中SOD是機體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，它通過上述反應(yīng)可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫[10]。CAT則是催化體內(nèi)廢物過氧化氫，將其分解為完全無害的水，減少對機體的損害[11]。腎臟是機體的重要器官，承擔(dān)機體排泄功能，可排除蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物和對機體有害的毒物和廢物，以調(diào)節(jié)體液平衡和調(diào)節(jié)電解質(zhì)酸堿平衡；分泌生物活性物質(zhì)，同時可以通過重吸收功能保留水分及其他有用物質(zhì)[12]。在魚類腎臟中含有豐富的抗氧化酶，因此通過研究不同濃度的苯并芘對魚類腎臟的SOD、CAT酶含量的影響來描述水體受污染的程度。目前，已有很多關(guān)于海洋魚類的報道[13～14]，但是在淡水魚方面的研究較少，而鯉魚又是淡水魚中的代表，希望通過研究苯并芘對鯉魚的抗氧化酶的影響為改善水環(huán)境的污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗時間：2016年6月；試驗地點：江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室。

1.1 試驗動物

試驗魚選購自無污染的漁場，所購鯉魚來自同一魚池，平均體質(zhì)量為(25.16±2.15)g，經(jīng)5%食鹽水消毒后進入實驗室[15]。

1.2 儀器與試劑

紫外分光光度計UV 2000(優(yōu)尼科)；勻漿機ART、苯并芘(BaP)，購自美國AccuStandard公司；助溶劑二甲基亞砜(DMSO)，購自美國Amreccr公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純級別。

1.3 試驗方法

1.3.1 暴露 所有試驗用魚在去氯自來水中培養(yǎng)，通過對水中成分分析，水中的重金屬元素幾乎沒有或者不能被監(jiān)測出來，水質(zhì)滿足鯉魚生存所需的要求。馴養(yǎng)2周后，隨機分組，每個處理組4尾。分別置于長×寬×高為100 cm×70 cm×50 cm的塑料缸中，盛水200 L/缸。試驗時每天更換用水，換水量為原來的1/2，以便濃度保持基本一致。試驗期間用充氣泵連續(xù)進行充氣，每天按時投放飼料，水溫基本控制在約23 ℃，自然光照，試驗進行30 d，并每5 d換1次水，徹底清洗水箱。將苯并芘溶于水中，由于苯并芘的溶解度比較小，所以在水中再加入助溶劑二甲基亞砜(DMSO)。4個處理組分別接受苯并芘濃度為0、0.1、0.5、1.0 μg/L的染毒，每個濃度設(shè)2個平行，對照組只投放二甲基亞砜(DMSO)[16]。

1.3.2 取樣及樣品處理 將魚撈出迅速解剖魚體取出腎臟，用預(yù)冷的0.9%生理鹽水沖洗表面血液，在濾紙上除去多余的液體后，-4 ℃保存，按質(zhì)量體積比1 g ∶10 mL加入0.9%生理鹽水充分勻漿，4 ℃下，5 000 r/min離心約10 min，去上清液進行酶活力分析和蛋白質(zhì)含量測定。每尾魚都獨立作為一個樣本。

1.4 酶活性的測定

1.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)的活性測定 采用黃嘌呤氧化酶法[17～18]。SOD活性的定義：1 mg蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制表達率達50%時，所對應(yīng)的SOD量為一個亞硝酸鹽單位(NU)。而鯽魚腎臟SOD活性用SOD試劑盒測定。

測定原理：腎臟SOD活性A(SOD)/(NU·mg)=2{(D對照管-D測定管)/D對照管}×(反應(yīng)液總體積/樣品量)/蛋白質(zhì)含量。

1.4.2 過氧化氫酶(CAT)的活性測定[19]CAT活性的定義：1 mg蛋白質(zhì)1 min分解底物過氧化氫的相對量為1個活力單位。

測定原理：CAT分解H2O2的反應(yīng)通過加入鉬酸銨中止反應(yīng)，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測定其生成量，可計算出CAT活力。

1.5 蛋白質(zhì)含量的測定

樣品中蛋白質(zhì)含量用Lowry法測定，以牛血清白蛋白為參照[18]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0版軟件進行單因素方差分析處理，并用CORREL進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯并芘對鯉魚腎臟超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

不同濃度的苯并芘30 d后對鯽魚腎臟中SOD的影響見圖1。由圖1可見，不同濃度苯并芘水溶液暴露30 d后，0.1、0.5、1.0 μg/L濃度組分別比對照組高6.355 U/mg、低 0.415 U/mg、低2.985 U/mg。Excel軟件中的CORREL函數(shù)相關(guān)性分析表明，鯉魚在含有不同濃度苯并芘的水中暴露 30 d 后，SOD活性與苯并芘濃度(r=-0.81)呈負相關(guān)。苯并芘濃度在 0.1 μg/L 與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；在濃度為 1.0 μg/L 與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.2 苯并芘對鯉魚腎臟過氧化氫酶(CAT)活性的影響

由圖2可見，不同濃度苯并芘水溶液暴露30 d后，0.1、0.5、1.0 μg/L濃度組分別比對照組高1.155 U/mg、低 0.993 U/mg、低1.678 U/mg。Excel軟件中的CORREL函數(shù)相關(guān)性分析表明，鯉魚在含有不同濃度苯并芘的水中暴露 30 d 后，CAT活性與苯并芘濃度(r=-0.92)呈負相關(guān)，且在濃度為1.0 μg/L時，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

3 討論

苯并芘屬多環(huán)芳香烴類的環(huán)境污染物，在自然界分布廣、致癌性強，通常將其作為環(huán)境致癌物的代表，是主要的環(huán)境污染檢測對象[1，3]。

水體中的污染物主要是PAHs，苯并芘是PAHs典型的一種[3]。因此，本試驗通過對不同濃度的苯并芘對鯽魚腎臟SOD、CAT含量影響的研究，以期為水體監(jiān)測提供一些數(shù)據(jù)。據(jù)有關(guān)研究試驗表明，在抗氧化防御系統(tǒng)中，對低濃度污染物的感染，酶的活力或活性物質(zhì)的含量升高；當(dāng)污染程度不斷加大，對機體已經(jīng)構(gòu)成損害，那么抗氧化酶的活力或活性物質(zhì)的含量則會下降[25]。本試驗中所得到的數(shù)據(jù)和結(jié)論與之相同，即當(dāng)苯并芘濃度較低時(0.1 μg/L)，SOD和CAT的活性均高于對照組，當(dāng)苯并芘濃度逐漸加大時，SOD和CAT的活性均低于對照組。且其相關(guān)性分別為-0.81和-0.92，說明變化整體是呈下降趨勢的，這可能因為當(dāng)機體受到外來物質(zhì)感染時，刺激機體的抗氧化性防御機制，使得抗氧化酶SOD和CAT大量產(chǎn)生，將體內(nèi)自由基清除，從而起到保護機體的作用；但是隨著感染濃度的加大，機體的抗氧化防御作用有限，可能造成活性氧自由基的積累和對細胞膜的損傷，降低機體的健康水平[19]。

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