范 昆， 曲健祿， 付 麗， 張 勇， 武海斌， 陶吉寒

(山東省果樹研究所，山東泰安 271000)

葡萄灰霉病是由灰葡萄孢霉(BotrytiscinereaPers.)引起的葡萄生產(chǎn)中危害最大的病害之一，年度損失20%左右，發(fā)病嚴(yán)重的果園病穗率可達(dá)50%以上。葡萄灰霉病除在生長季危害果實(shí)外，產(chǎn)后的貯藏階段也能引起毀滅性地?fù)p失[1]。

目前，生產(chǎn)上防治葡萄灰霉病仍以化學(xué)防治為主，由于灰霉病菌繁殖速度快、遺傳變異大、適合度高，加之田間連續(xù)多年使用單一藥劑防治，灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、乙霉威等殺菌劑已產(chǎn)生了抗藥性，甚至出現(xiàn)了多重抗藥性[2-7]。同時(shí)，由于群眾防治觀念落后、重治輕防、盲目用藥、濫用農(nóng)藥的現(xiàn)象比較普遍，造成農(nóng)殘超標(biāo)、果園生態(tài)環(huán)境受到破壞，嚴(yán)重影響了葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，對出口創(chuàng)匯也造成了較大的不良影響，產(chǎn)值大大降低。為此，本研究選取多種低毒、低殘留的殺菌劑于2014、2015年對葡萄灰霉病病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測定和田間藥效試驗(yàn)，以期篩選出防治該病害的理想藥劑，有效防治葡萄灰霉病，為葡萄優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 從山東省泰安市岱岳區(qū)南王莊村葡萄園采集病果，參照方中達(dá)的組織分離法[8]，從病果皮部病斑病健交界處切下3 mm×3 mm×1 mm的小塊，放入70%乙醇溶液中消毒30 s，然后將其轉(zhuǎn)入1%氯化汞溶液中消毒1 min，用無菌水清洗3遍后，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上。在26 ℃條件下培養(yǎng)3 d后挑取菌落邊緣的菌絲進(jìn)行病原菌的初步純化，將純化后的菌株在PDA試管斜面中于4 ℃冰箱中保存，備用。純化后的菌絲培養(yǎng)5 d后鏡檢菌絲、孢子的形態(tài)，并進(jìn)行病原菌鑒定[9-10]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.2 殺菌劑對葡萄灰霉病病菌孢子萌發(fā)的影響 采用懸滴法[11]測定殺菌劑對葡萄灰霉病病菌孢子萌發(fā)的抑制作用。將灰霉病病菌置于26 ℃條件下黑暗培養(yǎng)3 d，促使其產(chǎn)孢。待產(chǎn)孢后，用無菌去離子水將孢子洗脫并調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至1×105個(gè)/mL，并加葡萄糖配制成含糖0.01%的孢子懸浮液。將每個(gè)濃度的藥液與100 μL孢子懸浮液等體積混合，分別將混合液按濃度從小到大滴1滴于凹玻片中的凹槽內(nèi)，將凹玻片迅速翻轉(zhuǎn)使液滴倒懸在凹玻片下表面，小心將凹玻片放于加水培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)，以不加藥者為對照。置于26 ℃培養(yǎng)箱中，鏡檢孢子萌發(fā)情況。當(dāng)對照組孢子萌發(fā)率達(dá)到80%以上時(shí)即可鏡檢各處理組孢子的萌發(fā)情況，以孢子的芽管長度大于孢子短半徑為萌發(fā)，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。試驗(yàn)重復(fù)2次。采用機(jī)率值分析法求出各藥劑對菌株孢子萌發(fā)的毒力回歸方程、有效抑制中濃度(EC50)。

萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100%；

抑制率=(對照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率)/對照組孢子萌發(fā)率×100%。

1.2.3 殺菌劑對葡萄灰霉病病菌菌絲生長的影響 采用菌絲生長速率法[12]，在PDA平板上培養(yǎng)(26 ℃，黑暗)3 d的菌落邊緣打出直徑為7 mm的菌餅，分別移到含藥的培養(yǎng)基平板上，置于26 ℃暗培養(yǎng)3 d，測定菌落徑向線性生長量，確定藥劑對菌絲生長的抑制率。每個(gè)處理重復(fù)4次，試驗(yàn)重復(fù)2次。通過菌絲生長抑制概率值和藥劑濃度對數(shù)值之間的線性回歸分析，求出各藥劑對菌株的有效抑制中濃度(EC50)[13]。

抑制生長率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)]×100%。

1.2.5 藥效調(diào)查方法 5月4日第1次施藥時(shí)調(diào)查發(fā)病基數(shù)。因第1次施藥時(shí)未發(fā)病，故發(fā)病基數(shù)為0。6月5日(第3次施藥8 d后)調(diào)查1次發(fā)病情況，調(diào)查完進(jìn)行第4次噴藥，藥劑晾干后對果穗進(jìn)行套袋。果實(shí)采收期(8月5日)調(diào)查1次發(fā)病情況，共調(diào)查3次。

每個(gè)小區(qū)除邊緣2株樹外，調(diào)查其余6株樹中、下部果穗，按5點(diǎn)取樣法隨機(jī)調(diào)查20個(gè)果穗，調(diào)查病果(穗)率及受害級別，計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

分級方法：0級，無病斑；1級，病果(穗)面積占整個(gè)果穗面積的5%及以下；3級，病果(穗)面積占整個(gè)果穗面積的6%～15%；5級，病果(穗)面積占整個(gè)果穗面積的16%～25%；7級，病果(穗)面積占整個(gè)果穗面積的26%～50%；9級，病果(穗)面積占整個(gè)果穗面積的51%及以上。

病果(穗)率=病果(穗)數(shù)/調(diào)查總果(穗)數(shù)×100%；

病情指數(shù)=∑[(各級病果(穗)數(shù)×相對級數(shù)代表值)]/[調(diào)查總果(穗)數(shù)×9]×100；

防治效果=(空白對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù))/空白對照區(qū)病情指數(shù)×100%。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由Microsoft Excel 2010、DPS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)其差異性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑對葡萄灰霉病病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

表1 殺菌劑對葡萄灰霉病病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

2.2 殺菌劑對葡萄灰霉病病菌菌絲生長的抑制作用

表2 殺菌劑對葡萄灰霉病病菌菌絲生長的抑制作用

2.3 13種殺菌劑對葡萄灰霉病的田間防治試驗(yàn)

表3 殺菌劑對葡萄灰霉病的田間防治效果

注：表中數(shù)據(jù)為4次重復(fù)的平均值；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

同時(shí)，為防止葡萄灰霉病病菌抗藥性的快速產(chǎn)生和增長，建議在防治葡萄病害的管理過程中，合理混用或輪換使用不同作用機(jī)制的殺菌劑，并考慮葡萄的生長階段、氣候條件、田間管理及不同品種的抗病性等因素進(jìn)行綜合管理，以延緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生，延長殺菌劑在果樹病害管理體系中的使用壽命。

[1]張 瑋，喬廣行，黃金寶，等. 中國葡萄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性檢測[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46(6)：1208-1212.

[2]丁 中，劉 峰，王會利，等. 番茄灰霉菌的多重抗藥性研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，32(4)：452-456.

[3]Bouchra C，Achouri M，Idrissi Hassani L M，et al. Chemical composition and antifungal activity of essential oils of seven Moroccan Labiatae againstBotrytiscinereaPers：Fr[J]. Journal of Ethnopharmacology，2003，89(1)：165-169.

[4]Kim B S，Park E W，Cho K Y. Population dynamics of sensitive and resistance phenotypes ofBotrytiscinereato benzimidazole，dicarboximide andN-phenylearbamate fungicides in Korea[J]. Journal of Pesticide Science，2000，25(4)：385-386.

[5]嚴(yán) 紅，燕繼曄，王忠躍，等. 葡萄灰霉病菌對3種殺菌劑的多重抗藥性檢測[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2012，29(4)：625-629.

[6]喬廣行，嚴(yán) 紅，么奕清，等. 北京地區(qū)番茄灰霉病菌的多重抗藥性檢測[J]. 植物保護(hù)，2011，37(5)：176-180.

[7]Latorre B A，F(xiàn)lores V，Sara A M，et al. Dicarboxyimide-resistant isolates ofBotrytiscinereafrom table grape in Chile：survey and characterization[J]. Plant Disease，1994，78(10)：990-994.

[8]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979.

[9]陸家云. 植物病原真菌學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[10]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[11]劉 霞. 昆蟲病原線蟲共生菌YL001菌株的代謝產(chǎn)物及其抑菌活性研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006.

[12]慕立義. 植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1994.

[13]范 昆，張雪丹，余賢美，等. 無花果炭疽病菌的生物學(xué)特性及8種殺菌劑對其抑制作用[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2013，43(1)：75-81.

[14]陳宇飛，文景芝，李立軍. 葡萄灰霉病研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37(5)：693-699.

成鐵龍，彭 冶，施季森，等. 低溫脅迫對雜交鵝掌楸幼苗活性氧和活性氮代謝的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(24)：99-102.