王 濤，王超楠，張 紅，溫娟娟，張 斌

(1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津科潤蔬菜研究所，蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300381)

植物基因組DNA的提取是重要的基礎(chǔ)性技術(shù)，也是影響后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵步驟[1]。目前，常用的大白菜基因組DNA提取方法主要是CTAB法和SDS法[2]，CTAB法中的CTAB能將破碎植物葉片細(xì)胞中的DNA溶解出來，再經(jīng)氯仿-異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)，最后得到DNA。SDS法中的SDS在高溫條件下能裂解植物細(xì)胞，使染色體離析、蛋白質(zhì)變性，釋放出DNA。這2種方法提取的DNA濃度高，且基因組DNA的完整性好，在植物分子育種研究上具有廣泛的應(yīng)用，但是其缺點(diǎn)也是很明顯的，過程復(fù)雜，整個(gè)提取過程約3 h，效率低，無法滿足快速檢測的需要，而且所用到的有些試劑存在毒性，對人的身體健康會(huì)造成一定的危害[3]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在大白菜育種工作中的應(yīng)用，經(jīng)常需要對成千上萬的大群體進(jìn)行DNA提取，如果應(yīng)用CTAB法或SDS法，則耗時(shí)長且工作量巨大。而分子標(biāo)記輔助選擇、純度鑒定等工作中所需的DNA量不大[4]，提取的DNA也不需要長時(shí)間保存。因此，尋找一種簡單、快速的DNA提取方法非常必要。

堿裂解法是一種快速提取植物基因組DNA的新方法，在堿性環(huán)境中，樣品的細(xì)胞膜和核膜被破壞[5]，染色體DNA變性分開[5]，然后加入Tris-HCl在DNA提取液中起到緩沖液的作用，使DNA去質(zhì)子化，提高其溶解性[6]。這種方法提取的DNA量少、DNA保存時(shí)間短，但是操作過程簡單，耗時(shí)短，能滿足基本的試驗(yàn)需要[7]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的應(yīng)用此種方法提取基因組DNA的有高粱[8]、水稻[9]、大豆[10]、玉米[11]、番茄[12]等，而堿裂解法在十字花科植物，如對大白菜基因組DNA提取中還未見相關(guān)的報(bào)道。本研究對堿裂解法進(jìn)行了改進(jìn)，并通過對幾種大白菜基因組DNA提取方法的比較，在保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和提高試驗(yàn)效率的基礎(chǔ)上，旨在找到一種能夠快速提取大白菜基因組DNA的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為抗根腫病的大白菜親本G57和感根腫病的大白菜親本G70，G70和G57雜交獲得F1，F(xiàn)1與感病親本G70回交構(gòu)建BC1群體，所有試驗(yàn)材料均由天津科潤蔬菜研究所提供。

2016年3月將試驗(yàn)的種子播種到育苗盤中，正常管理，育苗培養(yǎng)30 d后，待幼苗長到5～6片真葉時(shí)取樣，采集葉片2～3片保存于-80 ℃，用于DNA提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CTAB法[13]①取大白菜真葉0.2～0.3 g(1 cm×1 cm)葉片加入1.5 mL離心管中，加50 μL 2%的CTAB提取緩沖液，研磨，補(bǔ)至400 μL，65 ℃水浴40 min，每10 min拿出輕搖一次；②加入400 μL氯仿∶異戊醇(24∶1)，輕搖5 min；③12 000 r/min離心5 min；④取上清200 μL至新的1.5 mL離心管，加入預(yù)冷的異丙醇200 μL，混勻，-20 ℃放置20 min，取出離心管，12 000 r/min，離心10 min；⑤棄上清，加入150 μL預(yù)冷乙醇，上下顛倒，洗凈異丙醇，12 000 r/min，離心 5 min；⑥棄上清，室溫下晾干2 h；⑦加蒸餾水100 μL溶解DNA，備用。

1.2.2 二步CTAB法[14]①取大白菜真葉0.2～0.3 g(1 cm×1 cm)葉片加入1.5 mL離心管中，加50 μL 2%的CTAB提取緩沖液，研磨，補(bǔ)至400 μL，65 ℃水浴40 min，每10 min拿出輕搖一次；②加入400 μL氯仿∶異戊醇(24∶1)，輕搖5 min；③12 000 r/min，離心5 min；④取上清200 μL至新的離心管，備用。

1.2.3 堿裂解法Ⅰ ①取大白菜真葉0.2～0.3 g(1 cm×1 cm)葉片加入1.5 mL離心管中；②加100 μL 0.4 mol/L NaOH，研磨；③沸水浴1 min后，10 000 r/min，離心1 min；④取上清液10 μL至新的1.5 mL離心管，再加300 μL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH值 8.0)，混勻備用。

1.2.4 堿裂解法Ⅱ 共4步，其中步驟③，離心管10 000 r/min，離心1 min，其他3步同堿裂解法Ⅰ。

1.2.5 堿裂解法Ⅲ 共4步，其中步驟③中，不進(jìn)行沸水浴和離心過程，其他3步同堿裂解法Ⅰ。

1.2.6 堿裂解法Ⅳ ①取大白菜真葉0.2～0.3 g(1 cm×1 cm)葉片加入1.5 mL離心管中；②加入200 μL 0.4 mol/L NaOH，研磨；③沸水浴1 min，直接作為PCR的模板，備用。以上每種方法重復(fù)3次。

1.3 提取的基因組DNA質(zhì)量的檢測

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量(電泳緩沖液為1×TAE)，GelRed染色，在凝膠成像儀上成像、觀察。

1.4 PCR反應(yīng)

取不同方法獲得的DNA樣本2 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4.1 引物 分別為Bra019317、Bra019348、Bra019235-2和Bra019345-2。SSR標(biāo)記為本項(xiàng)目開發(fā)的與本抗源抗根腫病基因連鎖的分子標(biāo)記，引物由華大基因公司合成。

1.4.2 PCR反應(yīng)體系 20 μL，包括模板DNA 2 μL，F(xiàn)orward primer(10 μmol/L)1 μL，Reverse primer(10 μmol/L)1 μL，dNTPs(2.5 mmol/L each)2 μL，10×Buffer 2 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。

1.4.3 PCR 反應(yīng)程序 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.5 PCR產(chǎn)物檢測分析

2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的質(zhì)量(電泳緩沖液為1×TAE)，GelRed染色，在凝膠成像儀上成像、觀察。8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測條帶多態(tài)性。

1.6 不同提取方法DNA保存時(shí)間和保存條件的比較

將提取到的DNA分別保存于4 ℃和-20 ℃下，并分別于第1，10，30，45，60天對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測條帶的清晰度，判斷每種方法提取到DNA的保存時(shí)間和最佳的保存條件。

1.7 堿裂解法在抗根腫病基因分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用

選擇最優(yōu)的堿裂解法快速提取G57、G70、F1及BC1群體的DNA，用與抗根腫病基因連鎖的標(biāo)記Bra019345-2，對含抗病基因的單株進(jìn)行篩選，以檢驗(yàn)該方法在分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取基因組DNA質(zhì)量的檢測

將CTAB法、二步CTAB法和4種堿裂解法提取的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。由圖1可知，只有CTAB法提取的DNA顯示出特異性的電泳條帶，其他5種方法未見到特異性的電泳條帶，說明CTAB法提取基因組DNA的濃度高、質(zhì)量好，其他方法提取的DNA可能濃度偏低。

M.DNA MarkerⅠ；①～⑥.提取DNA的CTAB法、二步CTAB法、堿裂解法Ⅰ、堿裂解法Ⅱ、堿裂解法Ⅲ、堿裂解法Ⅳ。圖2-4同。M.DNA MarkerⅠ；①-⑥.DNA from CTAB method，two-step CTAB method，alkaline lysis methodⅠ，alkaline lysis methodⅡ，alkaline lysis method Ⅲ，alkaline lysis method Ⅳ.The same as Fig.2-4.

2.2 不同方法提取的DNA為模板的PCR擴(kuò)增效果的比較分析

分別以這6種方法提取的基因組DNA為模板，使用引物Bra019317和Bra019348進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

結(jié)果表明，二步CTAB法和堿裂解法Ⅳ提取的DNA為模板擴(kuò)增不出特異性條帶，而CTAB法和堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可以擴(kuò)增出特異性條帶，且條帶清晰、明亮。說明CTAB法和堿裂解法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ提取的基因組DNA能夠滿足PCR反應(yīng)的需要(圖2)。

A.引物Bra019317;B.引物Bra019348。A.The primer Bra019317;B.The primer Bra019348.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證幾種方法的準(zhǔn)確性，利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。由圖3可知，8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果一致，CTAB法和堿裂解法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都可以看到清晰的條帶，完全能夠滿足PCR擴(kuò)增的需要(圖3)。

圖3 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.3 The test results of 8% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis

2.3 DNA保存時(shí)間和保存條件的比較

為了判斷幾種方法提取DNA的保存時(shí)間，以及保存溫度對DNA保存時(shí)間的影響，第1 天時(shí)，把試驗(yàn)中6種方法提取到的DNA先用引物Bra019235-2進(jìn)行PCR，然后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。再把6種方法提取到的DNA分別置于4 ℃和-20 ℃的條件下保存，分別于第10，30，45，60天對DNA用引物進(jìn)行PCR，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，觀察記錄條帶情況。結(jié)果如圖4所示。

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可知，堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取到的DNA在30 d檢測時(shí)，4 ℃和-20 ℃條件下保存的效果都比較好，30～45 d堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取到的DNA在4 ℃條件下開始有明顯的降解，-20 ℃條件下的保存效果比4 ℃較好，但是DNA也略有降解，第60天檢測時(shí)，2種保存條件下，堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取到的DNA進(jìn)行PCR，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，已經(jīng)檢測不到條帶。對CTAB法、堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取DNA的保存時(shí)間進(jìn)行比較，CTAB法提取的DNA保存時(shí)間最長，堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取的DNA在30 d內(nèi)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測到清晰的特異性條帶，并可滿足進(jìn)一步試驗(yàn)的需要。

2.4 堿裂解法在抗根腫病基因分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，堿裂解法Ⅲ不僅效率高，提取的DNA也能滿足試驗(yàn)的需要。結(jié)合堿裂解法Ⅲ進(jìn)行F1群體和BC1群體的基因型鑒定，鑒定F1群體的雜交率及分子標(biāo)記輔助選擇BC1群體中含抗病基因的單株。堿裂解法Ⅲ提取抗、感大白菜親本、74株F1群體和74株BC1群體植株的基因組DNA，用與抗根腫病基因連鎖的標(biāo)記Bra019345-2進(jìn)行PCR，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，所有的F1群體和BC1群體植株都檢測到了清晰的條帶(圖5，6)。74株F1群體植株均表現(xiàn)為雜合條帶；74株BC1群體植株中有33株表現(xiàn)為感病條帶，41株表現(xiàn)為雜合抗病條帶。說明堿裂解法Ⅲ完全能夠滿足大群體純度鑒定及分子標(biāo)記輔助選擇中對基因組DNA質(zhì)量的要求。

圖6 BC1群體的8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果(1～74)Fig.6 The test results of BC1 population of 8% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis(1-74)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以CTAB法和堿裂解法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ制備的基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，都可以被檢測到清晰的條帶，而二步CTAB法和堿裂解法Ⅳ制備的基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測不到條帶。CTAB法的提取時(shí)間較長，提取成本也較高[15]。相比較而言，能檢測到條帶的3種堿裂解法耗時(shí)短，操作簡單，方便快速，實(shí)用性強(qiáng)，結(jié)合組織研磨儀可以高通量操作[16]，而且成本低，只用到NaOH和Tris-HCl 2種常規(guī)試劑，試驗(yàn)方法大大的簡化。尤其是堿裂解法Ⅲ，不需要沸水浴和離心，操作更為簡便，效率最高，檢測結(jié)果也好[17]，是值得推薦的方法。

相比較堿裂解法Ⅳ，加了Tris-HCl的堿裂解法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ制備的DNA作為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以檢測到清晰的條帶，說明使用堿裂解法提取大白菜基因組DNA時(shí)，Tris-HCl是必需的[18]。二步CTAB法成本低，耗時(shí)短，有文獻(xiàn)報(bào)道這種方法提取的玉米基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA的完整性較好[14]，但是在本試驗(yàn)中提取的大白菜基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，沒有檢測到特異性條帶，這可能和試驗(yàn)材料的不同有關(guān)。堿裂解法Ⅲ提取的基因組DNA在保存至30 d時(shí)，將基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物還能通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測到清晰的條帶，說明這種方法保存時(shí)間較長，可以應(yīng)用于大規(guī)模樣本的分子標(biāo)記篩選。

分子標(biāo)記輔助選擇育種，試驗(yàn)的對象都是一個(gè)大的群體[19-21]。傳統(tǒng)的CTAB法提取基因組DNA的步驟繁瑣，本試驗(yàn)尋找到的堿裂解法Ⅲ操作過程簡單，耗時(shí)短，且保存時(shí)間較長，可以滿足大白菜大批量快速檢測的需要。

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