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牛結(jié)核病(bovine tuberculosis)是一種主要由牛分枝桿菌引起的慢性消耗性人獸共患傳染病，在我國被列為二類動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為需通報的動物疫病[1]。該病一年四季均可發(fā)生，具有世界流行性。牛分枝桿菌不僅會引起牛自身生產(chǎn)力的下降，而且對人類健康也構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[2]。

目前，發(fā)達國家常采用比較變態(tài)反應(yīng)和牛結(jié)核γ-干擾素體外釋放試驗進行檢疫[3]，如歐美等發(fā)達國家常采用比較變態(tài)反應(yīng)試驗作為檢疫依據(jù)，以其強大的經(jīng)濟實力為支撐，撲殺結(jié)核陽性牛，從而控制和消滅牛結(jié)核病。牛結(jié)核γ-干擾素體外釋放試驗已在多國應(yīng)用，評價較好，澳大利亞、加拿大等國的臨床應(yīng)用表明，該方法既能保證靈敏度，又能極大地提高檢測的特異性[4]。

目前國內(nèi)主要是通過單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)(TST)來進行牛結(jié)核病的檢疫[5]，該方法價格低廉，但工作量大、所需時間長。此外，采用現(xiàn)行國標(biāo)GB/T 18645-2000執(zhí)行皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)進行牛結(jié)核病檢疫時，不同的提純結(jié)核菌素(PPD)批號、注射劑量等因素都會導(dǎo)致個體差異較大[6]，且其結(jié)果以皮膚厚度的增加數(shù)為評判標(biāo)準(zhǔn)，易造成主觀誤差，不適合牛結(jié)核病診斷[7-8]。牛結(jié)核γ-干擾素體外釋放試驗(國標(biāo)GB/T 32945-2016)可以作為TST的理想補充試驗[9-10]，但由于商品化BOVIGAMTM試劑盒價格昂貴，限制了其在我國的推廣應(yīng)用。近年來，國內(nèi)雖有不少學(xué)者建立了牛γ-干擾素ELISA檢測方法，但其檢測方法僅局限于實驗室，至今未有商品化試劑盒上市。

因此研制快速、靈敏度強、特異性高的診斷試劑盒是牛結(jié)核病檢疫中亟待解決的問題之一。本研究在牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測方法的基礎(chǔ)上[11]，試制出牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒，并進行了初步臨床應(yīng)用，為牛結(jié)核病的診斷提供了靈敏度高、特異性強的檢測方法和試劑。

1 材料與方法

1.1刺激劑與試劑盒 皮膚試驗用牛型純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，BOVIGAMTMMycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle購自Thermo Fisher公司，牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒由江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室試制，批次分別為S2013001，S2013002，S2013003。

1.2試驗用牛 中國東部地區(qū)14個奶牛群，隨機抽取健康奶牛和結(jié)核病疑似陽性奶牛，共計961頭活畜。

1.3牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測方法的建立

1.3.1包被抗體與檢測抗體使用量的確定 參照文獻[11]以含天然BoIFN-γ的陽性血漿和未刺激的陰性血漿作為樣品，純化單抗2G5采用1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 4個濃度梯度，HRP-5E11的稀釋度分別為1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000。通過采用正交方陣實驗，進行最佳包被抗體和檢測抗體使用濃度的摸索。

1.3.2判定標(biāo)準(zhǔn) 具體操作參照試劑盒說明書進行，通過受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，簡稱ROC曲線)和標(biāo)本與陰性對照比值法確定試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)(cut-off值)均約等于0.1。因此確定結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1判為陽性；牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值<0.1或牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值<0.1則判為陰性。

1.4試劑盒的試制與組裝 本研究的ELISA檢測試劑盒由本實驗室試制(批號分為S2013001、S2013002和S2013003)，系用針對牛γ-干擾素的特異性單克隆抗體包被96孔酶標(biāo)板，并配以陽性對照(凍干粉)、陰性對照(凍干粉)、樣品稀釋液、酶標(biāo)抗體、酶標(biāo)抗體稀釋液、含0.5% Tween-20的磷酸鹽洗滌液(20×)、底物顯色液及終止液組裝而成。再將封板膜和說明書放入試劑盒中，貼好外標(biāo)簽和側(cè)標(biāo)簽，從而完成試劑盒的組裝。

1.5 牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試劑盒的評價

1.5.1試制試劑盒靈敏度試驗 使用10組試劑盒檢驗質(zhì)控樣品對試制的牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒的靈敏度，測定試制的牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒的最低檢出量。

1.5.3試制試劑盒的保存期試驗 將試制的3個批次牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試劑盒放置于4 ℃冰箱進行保存，分別于0、1、3、6、9、12、15個月取出，進行靈感度和特異度檢驗，以確定試制試劑盒的保存期限。

1.6 試劑盒符合率評價

1.6.1單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)試驗 參照國家標(biāo)準(zhǔn)《動物結(jié)核病診斷技術(shù)(GB/T18645-2002)》進行，僅采用牛型PPD在奶牛頸部進行皮試變態(tài)反應(yīng)試驗，劑量為2 000國際單位(IU)/頭，分別于注射前和注射后72 h測量皮膚厚度并計算皮厚差，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.6.2商品化BOVIGAM試劑盒 使用BOVIGAMTMMycobacteriumbovisGamma Interferon Test Kit for cattle試劑盒檢測經(jīng)特異性抗原刺激的?？鼓摩?干擾素進行牛結(jié)核病診斷，具體操作參照試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測方法的建立

2.1.1包被抗體與檢測抗體使用量的確定 以含天然BoIFN-γ的陽性血漿和未刺激的陰性血漿作為樣品，采用正交方陣實驗，進行最佳包被抗體和檢測抗體使用濃度的摸索。結(jié)果如表1所示，當(dāng)純化單抗2G5以5 μg/mL包被，HRP-5E11以1∶1 000稀釋時，ELISA檢測的P/N值達到最大，因此確定為抗體最佳濃度。

2.1.2操作步驟的確定 使用5 μg/mL純化2G5抗體4 ℃過夜包被，100 μL/孔；洗滌4次，37 ℃孵育封閉2 h；洗滌4次，每孔中加入50 μL樣品稀釋液，分別將50 μL陽性對照、陰性對照加入到各孔中，37 ℃孵育2 h；洗滌5次，加入1∶1 000稀釋的酶標(biāo)抗體HRP-5E11，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h；洗滌5次，每孔中加入100 μL底物顯色液，37 ℃避光顯色10 min，在每孔中加入50 μL終止液，15 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測定OD450nm。

表1 最佳包被及檢測抗體使用濃度的確定
Tab.1 Optimal concentration of coating antibody and detecting antibody

檢測抗體稀釋度Detectinganti-bodydilution檢測樣品Sample包被抗體濃度(μg/mL)Concerationofcoatingantibody1.252.55101∶500P1.6091.991.9561.9N0.2010.1810.2390.284P/N8.0010.998.186.691∶1000P1.4511.6861.6761.67N0.0920.1050.0940.15P/N15.7716.0617.8311.131∶2000P1.0641.3941.3121.456N0.090.0990.1080.14P/N11.8214.0812.1510.401∶4000P0.6330.9150.8750.887N0.0790.0790.1020.089P/N8.0111.588.589.97

2.2牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試劑盒的評價

2.2.1靈敏度評價 使用10組試劑盒靈敏度檢驗質(zhì)控樣品，對實驗室試制的牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒進行檢測靈敏度評價。結(jié)果如表2顯示，試制的3批牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒的最低檢出量達到8.21 ng/mL，表明試制的牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒具有較高的靈敏度，達到臨床診斷試劑盒要求。

2.2.2試劑盒批內(nèi)及批間重復(fù)性評價 進行試制ELISA試劑盒的批內(nèi)重復(fù)性(S2013001-1、S2013001-2和S2013001-3)試驗，結(jié)果如表3所示，陽性對照和陰性對照的變異系數(shù)分別為3.34%和7.58%，均小于10%，表明同一批次的試劑盒之間重復(fù)性良好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。同時，進行試制ELISA試劑盒的批間重復(fù)性(S2013001、S2013002和S2013003)試驗，結(jié)果如表3所示，陽性對照和陰性對照的變異系數(shù)分別為3.74%和8.20%，均小于10%，表明不同批次的試劑盒之間重復(fù)性良好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 3批牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒檢出量
Tab.2 Detection limit of three batches of kits

編號NumberBPPD組(OD)GroupBPPDγ-干擾素濃度(ng/mL)TheconcentrationofInterferongammaSP13.1200259.98SP22.8040231.77SP32.5700210.88SP42.2320180.70SP51.9050151.50SP61.7120134.27SP71.3800104.63SP81.075077.39SP90.667240.98SP100.30028.21

2.2.3試劑盒保存期評價 組裝好的試劑盒在4 ℃冰箱中放置15個月，分別于0、1、3、6、9、12、15個月取出，進行試劑盒檢測效果的評價。保存期試驗結(jié)果顯示，試劑盒在4 ℃條件下保存性能穩(wěn)定，進行靈敏度檢驗和特異度檢驗，ELISA檢測OD值無明顯變化，穩(wěn)定性良好，表明試制的ELISA試劑盒的保存期至少達到12個月以上。

2.3 試劑盒符合率評價

2.3.1牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA試劑盒和單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)的比較 將961頭試驗牛同時使用試制的牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒和單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)進行檢測。結(jié)果顯示，兩種方法的陽性一致數(shù)為18頭，陽性一致率為70.59%，陰性一致數(shù)為928頭，陰性一致率為99.20%，兩者總一致率為98.44%，結(jié)果見表4。

表3 試制ELISA試劑盒重復(fù)性試驗
Tab.3 Reproducibility of sandwish ELISA kit

重復(fù)性Reproducibility樣品Sample試劑盒(OD450nm)kits123C.V(%)批內(nèi)Intra-assay陽性對照PositiveControl2.1062.1322.1891.9872.1022.0971.9872.1382.0323.34陰性對照NegativeControl0.0560.0650.0680.0680.0720.0650.0710.0730.0677.58批間Inter-assay陽性對照PositiveControl1.9051.8971.971.9872.0652.0971.8962.0432.1324.49陰性對照NegativeControl0.0580.0690.060.0680.0720.0680.0740.0730.0678.13

2.3.2牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA試劑盒和商品化BOVIGAMTM試劑盒的比較 將961頭試驗牛同時使用試制牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒和商品化BOVIGAMTM試劑盒進行檢測。結(jié)果顯示，兩者之間的陽性一致數(shù)為21頭，陽性一致率為91.30%，陰性一致數(shù)為936頭，陰性一致率為99.78%，兩者總一致率為99.58%，結(jié)果見表4。

表4 試制ELISA試劑盒與兩種檢測方法的比較結(jié)果
Tab.4 Comparative result of sandwich ELISA kit and other two tests 頭

皮試變態(tài)反應(yīng)試驗TST合計TotalBOVIGAMTM試劑盒BOVIGAMTMkit合計Total陽性Positive陰性Negative陽性Positive陰性Negative試制ELISA試劑盒Gamma-interferonsandwichELISAkit陽性Positive1842221122陰性Negative119289393936939合計Total2993296124937961

以皮試變態(tài)反應(yīng)試驗和BOVIGAMTM試劑盒檢驗結(jié)果作為參考，以上2種方法檢測均為陽性的奶牛判定為牛結(jié)核陽性(共20頭)，兩種方法檢測均為陰性的奶牛判定為牛結(jié)核陰性(共928頭)，結(jié)果顯示試制的牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒的靈敏度達到85.00%(17/20)，特異度達到100.00%(928/928)。

3 討 論

結(jié)核病是威脅人類健康的重大疫病之一，結(jié)核病的防控一直被世界衛(wèi)生組織高度重視，投入的結(jié)核病防控治療基金也在逐年上升[12]。目前，國內(nèi)外檢測牛結(jié)核的方法主要包括細菌學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法[13]。在免疫學(xué)檢測方法中，結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)被廣泛使用，但其具有靈敏度和特異度不高、檢測時間較長等缺點。

1990年，Wood等[14]建立了通過檢測牛PPD刺激牛全血釋放的γ-干擾素，從而診斷牛結(jié)核病的ELISA方法。國內(nèi)雖有不少學(xué)者建立了牛γ-干擾素ELISA檢測方法[15-16]，但至今未有成型的商品化試劑盒上市，所以國內(nèi)牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測方法的發(fā)展，與研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的牛結(jié)核γ-干擾素檢測試劑盒是必然趨勢。

本實驗室建立了牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測方法，在此基礎(chǔ)上試制了3批試劑盒，并對其進行了評價。試制的3批牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒對質(zhì)控樣品的最低檢出量達到8.21 ng/mL，與商品化BOVIGAMTM試劑盒相當(dāng)。在進行重復(fù)性試驗時，不同批內(nèi)的試劑盒的陽性對照和陰性對照的變異系數(shù)分別為3.34%和7.58%，不同批次的試劑盒的陽性對照和陰性對照的變異系數(shù)分別為3.74%和8.20%，變異系數(shù)均<10%，重復(fù)性均良好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。同時試劑盒的保存期在12個月以上。

臨床試驗顯示，試制的牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒與皮試變態(tài)反應(yīng)相比，陽性一致率為70.59%，陰性一致率為99.20%，總一致率為98.44%；與商品化BOVIGAMTM試劑盒相比，陽性一致率為91.30%，陰性一致率為99.78%，總一致率為99.58%。以皮試變態(tài)反應(yīng)和商品化BOVIGAMTM試劑盒檢測結(jié)果作為參考進行分析，結(jié)果顯示試制的試劑盒靈敏度達到85.00%，特異度達到100.00%。結(jié)果表明，試制的牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒檢測效果較好，有望用于臨床牛結(jié)核病的檢測。

本試制的牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒減少了結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗中操作和解釋上的主觀性，使結(jié)果更為客觀、可靠，具有較好的特異性和敏感性[17]，且與商品化BOVIGAMTM試劑盒相比，試制的牛結(jié)核γ-干擾素夾心ELISA檢測試劑盒在符合率得到保障的同時成本較低，適合國內(nèi)推廣。通過將試制的試劑盒與單純皮試變態(tài)反應(yīng)共同檢測牛結(jié)核，也可降低假陽性和假陰性檢出率[18-19]，提高檢測的準(zhǔn)確性，為我國牛結(jié)核病的檢疫和根除提供了一種實用、有效的檢測試劑。

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