陳石蕊 李金城 李子超 薛小燕 章薇 毛星剛* 章翔*

(第四軍醫(yī)大學(xué): 1西京醫(yī)院神經(jīng)外科; 2學(xué)員隊(duì)三大隊(duì)一中隊(duì);3學(xué)員隊(duì)二大隊(duì)二中隊(duì);4藥學(xué)系藥理學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是成人中最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腦腫瘤，其中位生存期僅為1年左右[1]。豐富的血管發(fā)生及浸潤(rùn)生長(zhǎng)是GBM的典型病理特點(diǎn)，也是其手術(shù)難以完全切除、容易復(fù)發(fā)的因素[2]。目前除公認(rèn)的化療藥物替莫唑胺(temozolomide, TMZ)外，近年來(lái)唯一獲得FDA批準(zhǔn)使用腦膠質(zhì)瘤治療的抗血管藥物為貝伐單抗(Bevacizumab, BEV)[3]。BEV是重組的人源化血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)單克隆抗體。目前研究認(rèn)為，VEGF是作用最為明顯的血管生長(zhǎng)因子。GBM具有豐富的血管結(jié)構(gòu)，其VEGF的表達(dá)水平較低級(jí)別膠質(zhì)瘤高出了約10倍，且其表達(dá)水平與腫瘤惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。由于VEGF同時(shí)具有抑制血管生成和水腫的作用，成為抗血管治療一個(gè)極具前景的靶點(diǎn)?？寡芩幬镌诙喾N實(shí)體瘤的治療中取得了一定的臨床療效。然而，抗血管治療尚存在爭(zhēng)議，其最大的問(wèn)題是可導(dǎo)致腫瘤耐藥及浸潤(rùn)性進(jìn)展[4]。多數(shù)GBM患者經(jīng)抗血管治療后可有短暫的臨床緩解期，但最后出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展、耐藥，以致抗血管治療失敗。

GBM有原發(fā)和繼發(fā)性之分。原發(fā)性GBM生長(zhǎng)迅速，通常不伴有IDH1突變；而繼發(fā)性GBM則生長(zhǎng)緩慢，一般從低級(jí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤進(jìn)展而來(lái)，常伴有IDH1突變。原發(fā)和繼發(fā)性GBM具有相同的病理組織學(xué)特點(diǎn)，包括明顯的細(xì)胞增殖、異型性、核分裂、壞死并常伴有偽柵欄樣結(jié)構(gòu)(pseudopalisades)、豐富的異常血管結(jié)構(gòu)等。GBM腫瘤細(xì)胞最初在正常血管附近聚集，以獲得其生長(zhǎng)所需的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。然而，隨著腫瘤迅速增殖，GBM細(xì)胞可破壞其周?chē)艿耐暾浴Ｑ艿钠茐膶?dǎo)致瘤組織局部缺氧；另一方面，瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)可因距離最近的血管太遠(yuǎn)而產(chǎn)生缺氧。這種缺氧環(huán)境可導(dǎo)致部分瘤細(xì)胞死亡；然而，還有一部分瘤細(xì)胞可存活并繼續(xù)增殖。缺氧環(huán)境更有利于腫瘤干細(xì)胞的存活。存活的GBM細(xì)胞激活眾多的信號(hào)通路如缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor, HIF)，最終使存活的細(xì)胞獲得適應(yīng)低氧環(huán)境的能力，再次激活瘤組織中血管再生以及瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展。

一、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與缺氧

越來(lái)越多的研究表明，在惡性血液病及實(shí)體腫瘤中(如皮膚癌，乳腺癌，結(jié)腸癌等)均存在腫瘤干細(xì)胞。其中，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells, GSCs)具有無(wú)限的自我更新及重啟腫瘤生長(zhǎng)的潛在能力[5]。極少量的GSCs種植到免疫缺陷小鼠的顱內(nèi)即可導(dǎo)致腫瘤的形成。由于GSCs對(duì)GBM的重要性，現(xiàn)今對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了許多深入研究[6-7]。GSCs雖然具有異常的分化信號(hào)，但仍可表達(dá)可識(shí)別的細(xì)胞譜系特征：例如GSCs具有分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、及內(nèi)皮細(xì)胞的潛能。此外，GSC還系對(duì)放療及化療抵抗的重要工具。事實(shí)上，通過(guò)化學(xué)治療后存活的瘤組織中富含GSCs[8]。

膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中實(shí)際上包含了不同類(lèi)型以及不同分化程度的細(xì)胞，因而，確切地標(biāo)記出腫瘤內(nèi)GSCs有一定困難。如何定義并標(biāo)記GSCs仍是一個(gè)值得探究的研究領(lǐng)域。目前有很多分子可用于GSCs定位，如Olig2、Musashi1、Sox2、Nestin和Nanog；還有一些細(xì)胞表面標(biāo)記分子，包括CD44、CD15、α6整合素和CD133等。事實(shí)上，由于膠質(zhì)細(xì)胞瘤及GSCs的異質(zhì)性，沒(méi)有單一的分子可作為準(zhǔn)確的GSCs標(biāo)記物。大規(guī)模的全基因組分析指出：GBM 還可分為4個(gè)亞型，如前神經(jīng)亞型(Proneural, PN)，神經(jīng)亞型(Neural, NE)，經(jīng)典亞型(Classical, CL)以及間質(zhì)亞型(Mesenchymal, ME)[9]。這些不同的亞型不僅具有不同的基因組表達(dá)特點(diǎn)，也具有不同的臨床特征及干細(xì)胞特性：PN亞型的GSCs主要表達(dá)CD133標(biāo)記，在體外培養(yǎng)時(shí)主要呈現(xiàn)為懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球樣干細(xì)胞；而ME亞型的GSCs細(xì)胞則表達(dá)CD44標(biāo)記，在體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)為半貼壁生長(zhǎng)。PN亞型的腫瘤患者平均生存期比ME亞型的長(zhǎng)一些。在對(duì)治療的反應(yīng)方面二者也有差異，如：CD44+的腫瘤細(xì)胞對(duì)放療抵抗性更強(qiáng)，而對(duì)TMZ較為敏感；CD133+的瘤細(xì)胞正好相反，其對(duì)放療較為敏感，對(duì)放療則不敏感。另外，TMZ治療膠質(zhì)瘤的機(jī)制主要是通過(guò)甲基化O6位的鳥(niǎo)嘌呤而破壞DNA，但是GSCs表達(dá)O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)，該酶可移除烷基而阻止細(xì)胞死亡。膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGMT啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致的MGMT表達(dá)降低的患者預(yù)后較好。因此，MGMT啟動(dòng)子甲基化可視為對(duì)TMZ敏感的一個(gè)因素。然而，GSCs在致病過(guò)程中還發(fā)展了與MGMT啟動(dòng)子甲基化無(wú)關(guān)的其他耐藥機(jī)制，使得GSCs化療抵抗性的機(jī)制更為復(fù)雜化[10]。

缺氧對(duì)GSCs的生存以及增殖具有重要意義，它導(dǎo)致的多灶性壞死是GBM的標(biāo)志性組織病理學(xué)特征之一。缺氧微環(huán)境對(duì)于GBM細(xì)胞進(jìn)展、代謝、遷徙、浸潤(rùn)和治療抵抗性均起著重要作用。腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)壞死區(qū)周?chē)恢旅艿募?xì)胞所環(huán)繞，形成偽柵欄樣的微觀結(jié)構(gòu)，是GBM特有的病理學(xué)特點(diǎn)。偽柵欄樣結(jié)構(gòu)區(qū)域的瘤細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記分子，富含GSCs樣細(xì)胞，因而這些缺氧區(qū)域是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活以及增殖的重要因素。研究指出，低氧環(huán)境可促進(jìn)非膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(non-GSCs)重編程為腫瘤干細(xì)胞，且對(duì)GSCs的自我更新具有重要作用。細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)主要由HIF家族轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)，其中HIF2α的表達(dá)與缺氧水平呈正相關(guān)，且可上調(diào)CD133表達(dá)水平。HIF2α還可正向調(diào)節(jié)GSCs的自我更新能力及眾多干細(xì)胞因子的表達(dá)，包括Oct4、Sox2和c-Myc等。另外，缺氧也誘導(dǎo)HIF1α表達(dá)。采用基因沉默技術(shù)抑制HIF1α后可降低CD133+細(xì)胞的數(shù)量、并同時(shí)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。缺氧環(huán)境下HIF1α介導(dǎo)的GSCs干細(xì)胞狀態(tài)的維持依賴于Notch信號(hào)通路的激活[11]。事實(shí)上，沉默HIF1α或抑制Notch信號(hào)通路后均可干擾缺氧條件下GSC干細(xì)胞狀態(tài)的維持。此外，HIF1α可與Notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用促進(jìn)其穩(wěn)定性，從而激活Notch信號(hào)通路，其信號(hào)通路抑制劑可阻斷缺氧誘導(dǎo)的GSCs的存活以及侵襲性。

二、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與血管分化

在GSCs的眾多特點(diǎn)中，一個(gè)值得注意的是GSCs具有分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的潛能[12]。正常人類(lèi)血管是一種高度結(jié)構(gòu)化的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，可為細(xì)胞、組織遞送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并運(yùn)輸細(xì)胞產(chǎn)物。然而，與正常組織不同，膠質(zhì)瘤組織中的血管結(jié)構(gòu)在形態(tài)和功能上都極為異常，其通透性較高，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)化差，且其構(gòu)成的血腦屏障功能不完整。這些特點(diǎn)使得膠質(zhì)細(xì)胞瘤中血管的運(yùn)氧功能障礙，從而導(dǎo)致腫瘤局部缺氧。正常組織中的血管形成主要通過(guò)血管發(fā)生和血管再生，血管發(fā)生一般是在發(fā)育過(guò)程中通過(guò)內(nèi)細(xì)胞分裂增殖而形成，而血管再生一般指在已有血管基礎(chǔ)上通過(guò)出芽方式形成新的血管。另外在膠質(zhì)瘤中，還存在獨(dú)特的異常血管發(fā)生情況，包括血管共生(vascular co-option, VCO)和血管擬化(vasculogenic mimicry, VM)[13]。

GSCs對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中血管發(fā)生具有多方面的作用：首先，CD133+的GSCs高表達(dá)VEGF，VEGF不僅可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖并形成血管結(jié)構(gòu)，還可促使局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞活性，從而募集骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞形成血管。更重要的是， GSCs本身可作為血管腔壁成分參與血管形成,這種現(xiàn)象成為腫瘤細(xì)胞的VM。參與VM的細(xì)胞一般是具有高度浸潤(rùn)性的瘤細(xì)胞。其次，人們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，尤其是具有與腫瘤細(xì)胞一致的基因組突變，提示其與腫瘤細(xì)胞具有相同來(lái)源。更多的研究表明，CD133+的GSCs可分化為中間體的CD133+/CD144+細(xì)胞，并進(jìn)一步分化為成熟CD144+內(nèi)皮細(xì)胞，所分化的內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性因子CD105、CD31、CD34和VEGFR-2[14]。這些結(jié)果表明：GSCs具有向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的潛能，從而參與腫瘤中的血管發(fā)生。

在正常腦及腫瘤組織中，血管周細(xì)胞是血管結(jié)構(gòu)的重要組成部分。最新的研究指出，GSCs還可分化為血管周細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤中的血管形態(tài)及功能的形成。事實(shí)上，GBM腫瘤組織中的絕大部分血管周細(xì)胞都來(lái)源于轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞[15]。通過(guò)基因技術(shù)特異性的消除血管周細(xì)胞后，可抑制腫瘤中的血管形成并抑制腫瘤生長(zhǎng)。有研究指出，血管周細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的遷移主要通過(guò)SDF-1/CXCR4信號(hào)軸實(shí)現(xiàn)，而GSCs向血管周細(xì)胞的分化依賴于TGF-β信號(hào)通路[15]。另外，Notch信號(hào)通路和HMGA2也對(duì)GSCs向血管周細(xì)胞分化發(fā)揮重要作用[16]。

三、缺氧參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞瘤血管發(fā)生

缺氧不僅調(diào)節(jié)GSCs的存活與增殖等腫瘤生物學(xué)性質(zhì)，還與GBMR的血管發(fā)生密切相關(guān)[17-18]：①缺氧可使多種血管發(fā)生因子表達(dá)上調(diào)(如VEGF、FGF、ADM、ZNF395等)；②缺氧可促進(jìn)GSCs干細(xì)胞狀態(tài)維持及增殖，并促進(jìn)GSCs分泌血管發(fā)生因子[19]；③缺氧可促進(jìn)GSCs的血管擬態(tài)或向血管細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞)分化，直接參與GBM中的血管發(fā)生[14-15,20]。例如，缺氧可促進(jìn)GSCs表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CDH5/CD144，并促進(jìn)其形成血管樣管腔結(jié)構(gòu)[20]。缺氧可調(diào)控大量基因表達(dá)，這些基因組成一個(gè)復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，此分子網(wǎng)絡(luò)中的重要基因包括缺氧誘導(dǎo)因子(HIF1α和HIF2α)、缺氧激活的細(xì)胞毒素、糖酵解代謝途徑、浸潤(rùn)及遷徙相關(guān)分子、非折疊蛋白反應(yīng)等，其功能涉及血管發(fā)生、耐藥性、干細(xì)胞維持、糖酵解代謝、細(xì)胞增殖、遷徙及浸潤(rùn)性等多方面生物學(xué)功能[21]。因而，以腫瘤缺氧反應(yīng)作為治療靶點(diǎn)成為具有潛力的研究方向。

四、抗血管治療及其耐藥性

由于在正常人體組織中血管發(fā)生并不活躍，因此針對(duì)血管發(fā)生的抗血管治療成為具有相對(duì)腫瘤特異性的重要策略。目前抗血管治療的方案主要包括給予或過(guò)表達(dá)血管發(fā)生抑制因子，如針對(duì)VEGFA及其受體的各種中和抗體、干擾內(nèi)皮細(xì)胞功能和抑制促血管發(fā)生因子的產(chǎn)生等。

在眾多的促進(jìn)血管發(fā)生的機(jī)制中，VEGF是目前研究最清楚的促進(jìn)血管發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路。關(guān)于VEGF家族生長(zhǎng)因子的成員、結(jié)構(gòu)、功能以及表達(dá)的調(diào)節(jié)已經(jīng)做了深入研究。膠質(zhì)瘤中的許多成分都可以產(chǎn)生VEGF，如腫瘤細(xì)胞、腫瘤基質(zhì)、炎癥細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等。VEGF可刺激瘤組織中內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF受體(VEGFR)，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和存活，并形成管腔結(jié)構(gòu)。它還具有血管擴(kuò)張作用，可增加血管通透性而加重腫瘤組織中的間隙壓力。VEGF亦可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌一氧化氮(nitric oxide, NO)合酶(nitric oxide synthase, NOS)，導(dǎo)致NO含量增加，而NO具有血管擴(kuò)張作用。VEGF的這些作用是GBM腫瘤中形成異常血管及不完善的血腦屏障的重要因素，也因此而成為重要的抗血管治療靶點(diǎn)。其中BEV是人工重組的VEGF單克隆抗體，可以阻止VEGF與受體的相互作用。BEV最初被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，隨后用于治療非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌、子宮頸癌、對(duì)鉑耐藥的卵巢癌等多種腫瘤的化療。

雖然BEV在許多腫瘤的治療中都取得了一定效果，但其對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療還存在一些問(wèn)題。BEV可使膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者病情得到緩解，但對(duì)于延長(zhǎng)患者生存期并無(wú)顯著效果。與其他一些抗腫瘤藥物類(lèi)似，BEV會(huì)很快導(dǎo)致瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，認(rèn)為BEV使瘤細(xì)胞耐藥的一個(gè)重要機(jī)制是其可致GBM細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。另外BEV的使用可激活不依賴于VEGF的其他血管發(fā)生途徑，如，BEV治療可致其他促進(jìn)血管再生相關(guān)因子的表達(dá)，包括bombina variegate peptide 8(BV8)、FGF1/2、IL-8等[22]。其次，缺氧環(huán)境可促進(jìn)GSCs向內(nèi)皮細(xì)胞或血管周細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血管擬態(tài)。由于BEV治療耐藥發(fā)生時(shí)腫瘤組織內(nèi)再次產(chǎn)生缺氧環(huán)境，而在缺氧環(huán)境下，GSCs可高表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子CD144，并促進(jìn)GSCs的血管擬態(tài)能力[20]。顯然，BEV在治療早期可以逆轉(zhuǎn)腫瘤組織內(nèi)異常的血管使之正常化，改善瘤組織內(nèi)的氧氣狀況，緩解缺氧環(huán)境所致的瘤細(xì)胞侵襲性。腫瘤的EMT則與缺氧環(huán)境密切相關(guān)。如缺氧可致MET表達(dá)升高，并通過(guò)MET/VEGFR2信號(hào)通路致EMT增強(qiáng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的侵襲性[23]。盡管如此，對(duì)于BEV耐藥機(jī)制的產(chǎn)生尚不完全清楚，由于抗血管的潛在治療前景，對(duì)耐藥機(jī)制的深入研究具有重要意義[22]。

五、展望

抗血管治療在多種腫瘤的治療中取得了一定的治療效果，其對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療具有潛在的應(yīng)用前景?？寡苤委煹臋C(jī)制是通過(guò)抑制腫瘤中的血管發(fā)生，使瘤組織發(fā)生缺血、缺氧性壞死而抑制瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。作為GBM中的重要微環(huán)境因素，缺氧可通過(guò)調(diào)控大量分子的表達(dá)，影響腫瘤的血管發(fā)生[20]、浸潤(rùn)性進(jìn)展等生物學(xué)特性。目前抗血管治療以及聯(lián)合其他治療策略的臨床研究已經(jīng)開(kāi)展，有一部分在臨床前期研究中取得了一定效果。作為膠質(zhì)細(xì)胞瘤耐藥性及浸潤(rùn)性進(jìn)展的重要因素[24]，缺氧可調(diào)控大量分子表達(dá)，這些分子相互作用形成一個(gè)復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)。針對(duì)缺氧調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究相應(yīng)治療靶點(diǎn)，有助于理解抗血管治療耐藥產(chǎn)生的機(jī)制，并最終為避免耐藥產(chǎn)生、提高膠質(zhì)細(xì)胞瘤抗血管治療效果提供理論與臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。