潘超，張萍，唐洲平

近幾年來，美國、歐洲、日本和中國相繼宣布了媲美“人類基因組計劃”的“腦科學計劃”。這項宏偉的工程將對大腦內近千億的神經(jīng)元和血管、神經(jīng)環(huán)路及其相互連接進行全面的研究。腦內的神經(jīng)環(huán)路連接和血管連接是實現(xiàn)腦功能的基本單元。因此，如何獲取高分辨的腦連接圖譜是進行腦科學研究的重中之重。

2010年華中科技大學光電實驗室駱清銘團隊采用其自主設計研發(fā)的具有顯微光學切片斷層成像系統(tǒng)（micro-optical sectioning tomography，MOST）和發(fā)明的小鼠全腦高爾基染色、樹脂包埋法，以“邊切片邊成像”的工作方式采集了小鼠腦高分辨高爾基結構三維數(shù)據(jù)集，是目前世界上最大的也是分辨率最高（0.33μm×0.33μm×1 μm）的鼠腦神經(jīng)突起網(wǎng)絡數(shù)據(jù)集[1]。隨后，陸續(xù)又利用全腦尼氏染色、印度墨水灌注等方法采集了小鼠神經(jīng)元、腦血管三維數(shù)據(jù)集[2-3]。新一代熒光MOST（fluorescence micro-optical sectioning tomography，fMOST）的開發(fā)，借助熒光標記的轉基因小鼠全腦樹脂包埋技術，fMOST系統(tǒng)在國際上首次成功獲取了熒光小鼠全腦范圍內長程投射神經(jīng)元結構分布數(shù)據(jù)集，結合開發(fā)的神經(jīng)元追蹤分析技術實現(xiàn)了對腦內特定神經(jīng)投射路徑的立體觀察和精確定量分析[4]（圖1）。此外，整體熒光染色技術已問世，有望通過特異性免疫熒光抗體標記血管，在一份腦圖譜中同時顯示特定神經(jīng)細胞、神經(jīng)投射及血管連接網(wǎng)絡[5]。

卒中是一類高發(fā)病率、高致死致殘率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前對卒中的發(fā)病機制、發(fā)病后的病理生理變化及神經(jīng)血管保護仍不甚明朗。如臨床上常見到相同類型的卒中患者，梗死部位和梗死大小均相同，而臨床預后可能完全不同，這很可能與患者側支循環(huán)尤其是微循環(huán)的代償能力不同有關。對于缺血性卒中，血管狹窄或閉塞后其腦內微循環(huán)是如何代償?shù)摹⑷毖獏^(qū)域神經(jīng)網(wǎng)絡的供血關系是怎樣變化的、出血性卒中后血腫占位及高顱內壓狀態(tài)下的顱內微循環(huán)是如何改變、卒中后自體血管再生的過程其發(fā)生發(fā)展機制及時空分布等，卒中后神經(jīng)投射通路是否重建、與卒中后患者康復密切相關的神經(jīng)重塑、血管代償?shù)?，也是卒中患者重要的治療靶點，目前研究亦處于較初級階段（圖2）。這些均是卒中研究的重點和難點，非常值得進一步研究。

圖1 通過顯微光學切片斷層成像系統(tǒng)技術構建腦神經(jīng)血管網(wǎng)絡

圖2 通過顯微光學切片斷層成像系統(tǒng)技術對卒中進行研究

磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）、電子計算機斷層掃描血管成像（computed tomography angiography，CTA）或數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）等血管成像技術能很好地觀察大血管，但對微血管尤其是毛細血管難以做到精確的標記和觀察。傳統(tǒng)的血管三維可視化技術手段如微計算機斷層掃描技術（micro-computed tomography，micro-CT）血管成像、同步輻射線顯微斷層血管成像等或成像分辨率低，或僅能顯示血管網(wǎng)絡，但丟失了神經(jīng)元信息，難以同步研究神經(jīng)網(wǎng)絡與血管網(wǎng)絡[6-7]。而對于微循環(huán)的研究，MOST系統(tǒng)可提供高分辨的三維可視化圖譜，結合fMOST和免疫標記技術理論上能同時實現(xiàn)血管和神經(jīng)細胞的共標記及共成像，未來借助MOST技術獲得卒中疾病圖譜將為進行卒中研究提供技術支持。

腦圖譜的繪制已在美國、歐洲、中國等國家相繼展開。目前的基本路線是從鼠類到非人靈長類再到人類，從正常腦圖譜到包括腦血管疾病、腦遺傳變性病等腦疾病圖譜，為研究腦疾病和開發(fā)腦功能、發(fā)展人工智能等提供強有力的技術支持。雖然鼠腦疾病圖譜的繪制研究正方興未艾，但由于物種特征相差較大，鼠腦內的神經(jīng)網(wǎng)絡連接、血管分布及代償特點與人類相差較大，不能深刻揭示人腦疾病后機制。為此，采用非人靈長類動物模擬人類疾病研究具有不可替代的作用。猴類動物的腦區(qū)分布及神經(jīng)網(wǎng)絡連接特點與人類更接近，其腦循環(huán)特點與人類相似，對研究腦缺血后的循環(huán)代償、卒中后的血管修復、卒中后神經(jīng)網(wǎng)絡連接的變化具有天然的優(yōu)勢。然而，采用非人靈長類動物代替鼠類研究主要具有以下難點：①鼠腦容量遠小于猴類，獲取猴類腦切片并繪制超微神經(jīng)血管網(wǎng)絡的系統(tǒng)研制難度更大，其數(shù)據(jù)量將遠大于鼠腦。目前單個小鼠全腦數(shù)據(jù)集的大小已達到10 TB級別，而繪制的非人靈長類全腦數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)量將到上百TB，甚至PB級別，因此處理非人靈長類動物的腦圖譜必然考驗大數(shù)據(jù)的計算和存儲能力，以及軟件技術的開發(fā)都提出了巨大挑戰(zhàn)[8]。②目前，單個鼠腦的樣本經(jīng)MOST獲取0.5 μm3精度的全腦數(shù)據(jù)集24 h不間斷切片成像需耗時3～10 d，若獲取猴類腦數(shù)據(jù)將耗費更長時間，可達數(shù)月之久，高強度的工作對儀器的壽命和保養(yǎng)提出了嚴苛的要求，亟待解決。③較大體積的腦樣本對樣品制備、染色標記技術要求更高?，F(xiàn)已有文獻報道采用改進的免疫熒光標記技術對一定厚度的生物樣本成功標記并獲取三維圖譜[5]，但尚未有研究解決如此大體積的腦標本標記難題，同時大量的抗體需求也增加了研究成本。

然而，MOST系統(tǒng)目前還是離體研究，不能在體觀察，現(xiàn)階段尚不能滿足連續(xù)動態(tài)觀察的需求。由于最后重建的三維圖譜是基于陽性染色標記的結構與周圍結構的分辨率對比，而當血腦屏障出現(xiàn)較大破壞時，如腦梗死后，壞死組織及水腫液等在染色過程中可能會被非特異性染色，造成背景干擾，這些對獲取三維結構造成了較大視覺影響，需待開發(fā)更完善的軟件系統(tǒng)進行辨識和分離。

1 Li A，Gong H，Zhang B，et al.Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain[J].Science，2010，330：1404-1408.

2 Wu J，He Y，Yang Z，et al.3D Brain CV：simultaneous visualization and analysis of cells and capillaries in a whole mouse brain with one-micron voxel resolution[J].Neuroimage，2014，87：199-208.

3 Xue S，Gong H，Jiang T，et al.Indian-ink perfusion based method for reconstructing continuous vascular networks in whole mouse brain[J].PLoS One，2014，9：e88067.

4 Gong H，Zeng S，Yan C，et al.Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution[J].Neuroimage，2013，74：87-98.

5 Renier N，Wu Z，Simon DJ，et al.iDISCO：a simple，rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging[J].Cell，2014，159：896-910.

6 Urao N，Okonkwo UA，F(xiàn)ang MM，et al.MicroCT angiography detects vascular formation and regression in skin wound healing[J].Microvasc Res，2016，106：57-66.

7 Plouraboue F，Cloetens P，F(xiàn)onta C，et al.X-ray highresolution vascular network imaging[J].J Microsc，2004，215：139-148.

8 杜久林，畢國強，駱清銘，等.腦科學研究新技術[J].中國科學院院刊，2016，31：783-792.