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肺結(jié)核診斷

中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會

前 言

本標準“第3章～第5章”為強制性條款，其余為推薦性條款。

本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標準代替WS 288—2008《肺結(jié)核診斷標準》。本標準與WS 288—2008相比,主要變化如下：

——增加了熒光染色顯微鏡檢查、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)檢查、分子生物學檢查（見 3.4.1 和 3.4.2）；

——修改了肺結(jié)核確診病例條件（增加了分子生物學檢查結(jié)果）（見 5.3）；

——增加γ-干擾素釋放試驗檢查（見3.4.4.2）；

——增加了支氣管鏡檢查及氣管、支氣管結(jié)核鏡下表現(xiàn)（見 3.5）；

——增加了結(jié)核病病理學檢查（見附錄 C）——增加了非結(jié)核分枝桿菌肺病診斷內(nèi)容（見附錄 E 中的 E.2）；

——增加了兒童肺結(jié)核診斷特點內(nèi)容（見 3.2.1和 3.3.1）。

本標準起草單位：中國疾病預防控制中心、首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院、首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院、中國人民解放軍第三〇九醫(yī)院。

本標準主要起草人：王黎霞、成詩明、周林、趙雁林、高孟秋、初乃惠、周新華、王擷秀、趙順英、屠德華、林明貴、李亮、李琦、李寧、吳雪瓊、劉二勇、賴鈺基、王勝芬、王前、馬艷。

本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為：

——GB 15987—1995；

——WS 288—2008。

1 范 圍

本標準規(guī)定了肺結(jié)核診斷依據(jù)、診斷原則、診斷和鑒別診斷。

本標準適用于全國各級各類醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)及其醫(yī)務(wù)人員對肺結(jié)核的診斷。

2 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

2.1 肺結(jié)核（pulmonary tuberculosis）發(fā)生在肺組織、氣管、支氣管和胸膜的結(jié)核病變。肺結(jié)核病原學參見附錄A。

2.2 結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis）簡稱結(jié)核桿菌，是人類結(jié)核病的病原菌。結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)為細長直或稍彎曲、兩端圓鈍的桿菌，長 1μm ～ 4μm，寬 0.3μm ～ 0.6μm。

3 診斷依據(jù)

3.1 流行病學史 有肺結(jié)核患者接觸史。

3.2 臨床表現(xiàn)

3.2.1 癥狀 咳嗽、咳痰≥2周，或痰中帶血或咯血為肺結(jié)核可疑癥狀。肺結(jié)核多數(shù)起病緩慢，部分患者可無明顯癥狀，僅在胸部影像學檢查時發(fā)現(xiàn)。隨著病變進展，可出現(xiàn)咳嗽、咳痰、痰中帶血或咯血等，部分患者可有反復發(fā)作的上呼吸道感染癥狀。肺結(jié)核還可出現(xiàn)全身癥狀，如盜汗、疲乏、間斷或持續(xù)午后低熱、食欲不振、體重減輕等，女性患者可伴有月經(jīng)失調(diào)或閉經(jīng)。少數(shù)患者起病急驟，有中、高度發(fā)熱，部分伴有不同程度的呼吸困難。

病變發(fā)生在胸膜者可有刺激性咳嗽、胸痛和呼吸困難等癥狀。 病變發(fā)生在氣管、支氣管者多有刺激性咳嗽，持續(xù)時間較長，支氣管淋巴瘺形成并破入支氣管內(nèi)或支氣管狹窄者，可出現(xiàn)喘鳴或呼吸困難。少數(shù)患者可伴有結(jié)核性超敏感癥候群，包括：結(jié)節(jié)性紅斑、皰疹性結(jié)膜炎/角膜炎等。

兒童肺結(jié)核還可表現(xiàn)發(fā)育遲緩，兒童原發(fā)性肺結(jié)核可因氣管或支氣管旁淋巴結(jié)腫大壓迫氣管或支氣管，或發(fā)生淋巴結(jié)-支氣管瘺，常出現(xiàn)喘息癥狀。

當合并有肺外結(jié)核病時，可出現(xiàn)相應(yīng)累及臟器的癥狀。

3.2.2 體征 早期肺部體征不明顯，當病變累及范圍較大時，局部叩診呈濁音，聽診可聞及管狀呼吸音，合并感 染或合并支氣管擴張時，可聞及濕性啰音。

病變累及氣管、支氣管，引起局部狹窄時，聽診可聞及固定、局限性的哮鳴音，當引起肺不張時，可表現(xiàn)氣管向患側(cè)移位，患側(cè)胸廓塌陷、肋間隙變窄、叩診為濁音或?qū)嵰?、聽診呼吸音減弱或消失。

病變累及胸膜時，早期于患側(cè)可聞及胸膜摩擦音，隨著胸腔積液的增加，患側(cè)胸廓飽滿，肋間隙增寬，氣管向健側(cè)移位，叩診呈濁音至實音，聽診呼吸音減弱至消失。當積液減少或消失后，可出現(xiàn)胸膜增厚、粘連，氣管向患側(cè)移位，患側(cè)胸廓可塌陷，肋間隙變窄、呼吸運動受限，叩診為濁音，聽診呼吸音減弱。

原發(fā)性肺結(jié)核可伴有淺表淋巴結(jié)腫大，血行播散性肺結(jié)核可伴肝脾腫大、眼底脈絡(luò)膜結(jié)節(jié)，兒童患者可伴皮膚粟粒疹。

3.3 胸部影像學檢查

3.3.1 原發(fā)性肺結(jié)核 原發(fā)性肺結(jié)核主要表現(xiàn)為肺內(nèi)原發(fā)病灶及胸內(nèi)淋巴結(jié)腫大，或單純胸內(nèi)淋巴結(jié)腫大。兒童原發(fā)性肺結(jié)核也可表現(xiàn)為空洞、干酪性肺炎以及由支氣管淋巴瘺導致的支氣管結(jié)核。

3.3.2 血行播散性肺結(jié)核 急性血行播散性肺結(jié)核表現(xiàn)為兩肺均勻分布的大小、密度一致的粟粒陰影；亞急性或慢性血行播散性肺結(jié)核的彌漫病灶，多分布于兩肺的上中部，大小不一，密度不等，可有融合。兒童急性血行播散性肺結(jié)核有時僅表現(xiàn)為磨玻璃樣影，嬰幼兒粟粒病灶周圍滲出明顯，邊緣模糊，易于融合。

3.3.3 繼發(fā)性肺結(jié)核 繼發(fā)性肺結(jié)核胸部影像表現(xiàn)多樣。輕者主要表現(xiàn)為斑片、結(jié)節(jié)及索條影，或表現(xiàn)為結(jié)核瘤或孤立空洞；重者可表現(xiàn)為大葉性浸潤、干酪性肺炎、多發(fā)空洞形成和支氣管播散等；反復遷延進展者可出現(xiàn)肺損毀，損毀肺組織體積縮小，其內(nèi)多發(fā)纖維厚壁空洞、繼發(fā)性支氣管擴張，或伴有多發(fā)鈣化等，鄰近肺門和縱隔結(jié)構(gòu)牽拉移位，胸廓塌陷，胸膜增厚粘連，其他肺組織出現(xiàn)代償性肺氣腫和新舊不一的支氣管播散病灶等。

3.3.4 氣管、支氣管結(jié)核 氣管及支氣管結(jié)核主要表現(xiàn)為氣管或支氣管壁不規(guī)則增厚、管腔狹窄或阻塞，狹窄支氣管遠端肺組 織可出現(xiàn)繼發(fā)性不張或?qū)嵶儭⒅夤軘U張及其他部位支氣管播散病灶等。

3.3.5 結(jié)核性胸膜炎 結(jié)核性胸膜炎分為干性胸膜炎和滲出性胸膜炎。干性胸膜炎為胸膜的早期炎性反應(yīng)，通常無明顯的影像表現(xiàn)；滲出性胸膜炎主要表現(xiàn)為胸腔積液，且胸腔積液可表現(xiàn)為少量或中大量的游離積液，或存在于胸腔任何部位的局限積液，吸收緩慢者常合并胸膜增厚粘連，也可演變?yōu)樾啬そY(jié)核瘤及膿胸等。

3.4 實驗室檢查

3.4.1 細菌學檢查 檢查方法見附錄 B。檢查結(jié)果如下：

a) 涂片顯微鏡檢查陽性；

b) 分枝桿菌培養(yǎng)陽性，菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌復合群。

3.4.2 分子生物學檢查 結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性。

3.4.3 結(jié)核病病理學檢查 結(jié)核病組織病理改變見附錄 C。

3.4.4 免疫學檢查

3.4.4.1 結(jié)核菌素皮膚試驗，中度陽性或強陽性（見附錄 D）。

3.4.4.2 γ-干擾素釋放試驗陽性。

3.4.4.3 結(jié)核分枝桿菌抗體陽性。

3.5 支氣管鏡檢查 支氣管鏡檢查可直接觀察氣管和支氣管病變，也可以抽吸分泌物、刷檢及活檢。

4 診斷原則

肺結(jié)核的診斷是以病原學（包括細菌學、分子生物學）檢查為主，結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像、相關(guān)的輔助檢查及鑒別診斷等，進行綜合分析做出診斷。以病原學、病理學結(jié)果作為確診依據(jù)。

兒童肺結(jié)核的診斷，除痰液病原學檢查外，還要重視胃液病原學檢查。

5 診 斷

5.1 疑似病例 凡符合下列項目之一者：

a) 具備 3.3 中任一條者；

b) 5 歲以下兒童：具備 3.2 同時具備 3.1，3.4.4.1，3.4.4.2 任一條。

5.2 臨床診斷病例 經(jīng)鑒別診斷排除其他肺部疾病，同時符合下列項目之一者：

a) 具備 3.3 中任一條及 3.2 者；

b) 具備 3.3 中任一條及 3.4.4.1 者；

c) 具備 3.3 中任一條及 3.4.4.2 者；

d) 具備 3.3 中任一條及 3.4.4.3 者；

e) 具備 3.3 中任一條及肺外組織病理檢查證實為結(jié)核病變者；

f) 具備 3.3.4 及 3.5 者可診斷為氣管、支氣管結(jié)核；

g) 具備 3.3.5 和胸水為滲出液、腺苷脫氨酶升高，同時具備 3.4.4.1，3.4.4.2，3.4.4.3 任一 條者，可診斷為結(jié)核性胸膜炎；

h) 兒童肺結(jié)核臨床診斷病例應(yīng)同時具備以下2 條：

1) 具備 3.3 中任一條及 3.2 者；2) 具備 3.4.4.1，3.4.4.2 任一條者。

5.3 確診病例

5.3.1 痰涂片陽性肺結(jié)核診斷 凡符合下列項目之一者：

a) 2 份痰標本涂片抗酸桿菌檢查符合 3.4.1.a者；

b) 1 份痰標本涂片抗酸桿菌檢查符合3.4.1.a，同時具備 3.3 中任一條者；

c) 1 份痰標本涂片抗酸桿菌檢查符合3.4.1.a，并且 1 份痰標本分枝桿菌培養(yǎng)符合 3.4.1.b者。

5.3.2 僅分枝桿菌分離培養(yǎng)陽性肺結(jié)核診斷 符合3.3中任一條，至少2份痰標本涂片陰性并且分枝桿菌培養(yǎng)符合3.4.1.b者。

5.3.3 分子生物學檢查陽性肺結(jié)核診斷 符合3.3中任一條及3.4.2者。

5.3.4 肺組織病理學檢查陽性肺結(jié)核診斷 符合3.4.3者。

5.3.5 氣管、支氣管結(jié)核診斷 凡符合下列項目之一者：

a) 具備 3.5 及氣管、支氣管病理學檢查符合3.4.3 者；

b) 具備 3.5 及氣管、支氣管分泌物病原學檢查，符合 3.4.1.a 或 3.4.1.b 或 3.4.2 者。

5.3.6 結(jié)核性胸膜炎診斷 凡符合下列項目之一者：

a) 具備 3.3 及胸水或胸膜病理學檢查符合3.4.3 者；

b) 具備 3.3 及胸水病原學檢查，符合 3.4.1.a或 3.4.1.b 或 3.4.2 者。

6 鑒別診斷

肺結(jié)核的癥狀、體征和影像學表現(xiàn)同許多胸部疾病相似，在診斷肺結(jié)核時，應(yīng)注意與其他疾病相鑒別（參見E.1），包括與非結(jié)核分枝桿菌肺病鑒別（參見E.2）。經(jīng)鑒定符合非結(jié)核分枝桿菌者按非結(jié)核分枝桿菌肺病處理。

附錄A（資料性附錄）肺結(jié)核病原學

A.1 結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)與染色特性 結(jié)核分枝桿菌細長略彎曲，聚集呈分枝狀排列增殖。因其細胞壁含有大量脂質(zhì)，不易著色，經(jīng)萋- 尼氏抗酸染色呈紅色，無菌毛和鞭毛，不形成芽孢（胞），現(xiàn)證明有莢膜。單在，成雙,間或成叢排列。 在人工培養(yǎng)基上，由于菌型、菌株和環(huán)境條件不同，可出現(xiàn)多種形態(tài)，如近似球形、棒狀或絲狀。在電鏡下觀察其具有復雜結(jié)構(gòu)：由微莢膜、細胞外殼的三層結(jié)構(gòu)、胞漿膜、胞漿、間體、核糖體及中間核質(zhì)構(gòu)成。

典型的結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)為細長稍彎曲或直的，兩端圓鈍的桿菌，長1 μm～4 μm，寬 0.3 μm～ 0.6 μm，單個散在，有時呈X、Y形或條索狀。痰標本涂片經(jīng)過抗酸染色后在100倍的生物顯微鏡下可以看到。

結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)外經(jīng)青霉素、環(huán)絲氨酸或溶菌酶誘導，可影響細胞壁中肽聚糖的合成，異煙肼影響分枝菌酸的合成，巨噬細胞吞噬結(jié)核分枝桿菌后溶菌酶的作用可破壞肽聚糖，均可導致其變?yōu)長型，呈顆粒狀或絲狀。

A.2 結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)特性 結(jié)核分枝桿菌為專性需氧菌，營養(yǎng)要求高，最適pH以6.5～6.8為宜，生長緩慢，初次分離需要營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。常用的有羅氏固體培養(yǎng)基，內(nèi)含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等?？兹妇G可抑制雜菌生長，便于分離和長期培養(yǎng)。蛋黃含脂質(zhì)生長因子，能刺激生長。根據(jù)接種菌多少，一般2周～4 周可見菌落生長。在固體培養(yǎng)基上菌落呈灰黃白色，干燥顆粒狀，顯著隆起，表面粗糙皺縮、菜花狀的菌落。在液體培養(yǎng)基內(nèi)，于液面形成粗紋皺膜，培養(yǎng)基保持透明。若加入吐溫80于培養(yǎng)基中，可使結(jié)核桿菌呈分散均勻生長，一般1周～2周即可生長。臨床標本檢查液體培養(yǎng)比固體培養(yǎng)的陽性率高數(shù)倍。菌體為細長略彎的桿菌，經(jīng)抗酸染色染成紅色。對干燥的抵抗力特別強，對酸堿有較強的抵抗力，易產(chǎn)生耐藥性變異及L型細菌。

A.3 結(jié)核分枝桿菌的生化特性 結(jié)核桿菌不發(fā)酵糖類，能產(chǎn)生過氧化氫酶。對人致病的結(jié)核分枝桿菌現(xiàn)一般認為有人型、牛型、非洲型。人型與牛型菌形態(tài)相似，對豚鼠皆有較強致病力，但人型菌對家兔致病力遠較牛型菌為弱。人型結(jié)核桿菌能合成煙酸，還原硝酸鹽，耐受噻吩—2—羧酸酰肼，牛型結(jié)核桿菌都不具備上述特性。人型 和牛型的毒株，中性紅試驗均陽性，無毒株，則中性紅陰性且失去索狀生長現(xiàn)象。熱觸酶試驗對區(qū)別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌有重要意義。結(jié)核分枝桿菌大多數(shù)觸酶試驗陽性，而熱觸酶試驗陰性，非結(jié)核分枝桿菌則大多數(shù)兩種試驗均陽性。熱觸酶試驗檢查方法是將濃的細菌懸液置68℃水浴加溫20 min，然后再加H2O2。觀察是否產(chǎn)生氣泡，有氣泡者為陽性。牛型結(jié)核分枝桿菌可經(jīng)飲用未消毒的帶菌牛乳引起腸道結(jié)核感染。顯微鏡下均為抗酸桿菌，細長稍彎，有時見人字型、Y型分枝，培養(yǎng)生長經(jīng)生化試驗可以鑒別菌型。

A.4 結(jié)核分枝桿菌的抵抗力 結(jié)核分枝桿菌對酸、堿、自然環(huán)境和干燥有抵抗力，但對濕熱、酒精和紫外線敏感，對抗結(jié)核藥物易產(chǎn)生耐藥性。結(jié)核分枝桿菌細胞壁中含有脂質(zhì)，故對乙醇敏感。75%酒精作用5 min～30 min死亡，液體中加熱62℃～63℃，30 min死亡。結(jié)核分枝桿菌對紫外線敏感，直接日光照射2 h～7 h可被殺死。紫外線可用于結(jié)核患者衣服、書籍等的消毒。

結(jié)核分枝桿菌在干燥痰內(nèi)可存活6個月～8個月，對抗結(jié)核藥物易產(chǎn)生耐藥性。結(jié)核分枝桿菌的抵抗力與環(huán)境中有機物的存在有密切關(guān)系，如痰液可增強結(jié)核分枝桿菌的抵抗力。因大多數(shù)消毒劑可使痰中的蛋白質(zhì)凝固，包在細菌周圍，使細菌不易被殺死。5%石炭酸在無痰時30 min可殺死結(jié)核分枝桿菌，有痰時需要24 h；5%來蘇兒無痰時5 min殺死結(jié)核分枝桿菌，有痰時需要1 h～2 h。

結(jié)核分枝桿菌對酸（3% HCl或6% H2SO4) 或堿（4% NaOH) 有抵抗力，15 min不受影響?？稍诜蛛x培養(yǎng)時用于處理有雜菌污染的標本和消化標本中的黏稠物質(zhì)。結(jié)核分枝桿菌對1∶13 000孔雀綠有抵抗力，加在培養(yǎng)基中可抑制雜菌生長。結(jié)核分枝桿菌對鏈霉素、異煙肼、利福平、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、卡那霉素、對氨基水楊酸等敏感，但長期用藥容易出現(xiàn)耐藥性。

A.5 結(jié)核分枝桿菌的變異性 結(jié)核分枝桿菌變異性包括：

a) 耐藥性變異：結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物較易產(chǎn)生耐藥性，造成耐藥菌株增多，給治療造成困難。

b) 毒力變異：將有毒的牛分枝桿菌培養(yǎng)于含甘油、膽汁、馬鈴薯的培養(yǎng)基中，經(jīng)230次移種傳代，歷時13年而獲得了減毒活菌株，即卡介苗，目前廣泛用于人類結(jié)核病的預防。

A.6 結(jié)核分枝桿菌的致病性 結(jié)核分枝桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素。其致病性可能與細菌在組織細胞內(nèi)大量繁殖引起的炎癥，菌體成分和代謝物質(zhì)的毒性以及機體對菌體成分產(chǎn)生的免疫損傷有關(guān)。致病物質(zhì)與莢膜、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)有關(guān)。

A.6.1 莢膜 莢膜的主要成分為多糖，部分脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。其對結(jié)核分枝桿菌的作用有：①莢膜能與吞噬細胞表面的補體受體3（CR3）結(jié)合，有助于結(jié)核分枝桿菌在宿主細胞上的黏附與入侵；②莢膜中有多種酶可降解宿主組織中的大分子物質(zhì)，供入侵的結(jié)核分枝桿菌繁殖所需的營養(yǎng)；③莢膜能防止宿主的有害物質(zhì)進入結(jié)核分枝桿菌，甚至如小分子NaOH也不易進入。故結(jié)核標本用4%NaOH消化時，一般細菌很快殺死，但結(jié)核分枝桿菌可耐受數(shù)十分鐘。結(jié)核分枝桿菌入侵后莢膜還可抑制吞噬體與溶酶體的融合。

A.6.2 脂質(zhì) 據(jù)實驗研究，細菌毒力可能與其所含復雜的脂質(zhì)成分有關(guān)，特別是糖脂更為重要。①索狀因子：是分枝菌酸和海藻糖結(jié)合的一種糖脂。能使細菌在液體培養(yǎng)基中呈蜿蜒索狀排列。此因子與結(jié)核分枝桿菌毒力密切相關(guān)。它能破壞細胞線粒體膜，影響細胞呼吸，抑制白細胞游走和引起慢性肉芽腫。若將其從細菌中提出，則細菌喪失毒力。②磷脂：能促使單核細胞增生，并使炎癥灶中的巨噬細胞轉(zhuǎn)變?yōu)轭惿掀ぜ毎?，從而形成結(jié)核結(jié)節(jié)。③硫酸腦苷脂（sulfatide）：可抑制吞噬細胞中吞噬體與溶酶體的結(jié)合，使結(jié)核分枝桿菌能在吞噬細胞中長期存活。④蠟質(zhì)D：是一種肽糖脂和分枝菌酸的復合物，可從有毒株或卡介苗中用甲醇提出，具有佐劑作用，可激發(fā)機體產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)。

A.6.3 蛋白質(zhì) 有抗原性，和蠟質(zhì)D結(jié)合后能使機體發(fā)生超敏反應(yīng)，引起組織壞死和全身中毒癥狀，并在形成結(jié)核結(jié)節(jié)中發(fā)揮一定作用。

A.7 結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng) 結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)感染菌，其免疫主要是以T細胞為主的細胞免疫。T細胞不能直接和胞內(nèi)菌作用，先與感染細胞反應(yīng)，導致細胞崩潰，釋放出結(jié)核分枝桿菌。機體對結(jié)核分枝桿菌雖能產(chǎn)生抗體，但抗體只能與釋出的細菌接觸起輔助作用。

A.7.1 免疫反應(yīng) 一直以來認為在天然免疫中巨噬細胞是結(jié)核感染的主要的靶細胞，也是機體抗結(jié)核感染的最早起作用和最具有代表性的細胞群。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在結(jié)核感染的發(fā)展中有重要作用的其他細胞群，如中性粒細胞，是最早被征集到炎癥部位，通過氧依賴的殺菌物質(zhì)和胞外捕獲機制來殺病原微生物。而且有研究者在感染實驗動物前，將中性粒細胞去除，結(jié)果分支桿菌生長增加；反之，實驗前用刺激中性粒細胞增殖的試劑，則分枝桿菌生長率降低。以及后來在中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)了防御素。然而，中性粒細胞不只是有這種對機體的保護作用，還有些報道顯示由于不同宿主對結(jié)核桿菌的敏感性的不同，中性粒細胞的病理損傷作用會超過其保護作用。細胞免疫反應(yīng)針對結(jié)核桿菌，如同其他胞內(nèi)感染菌一樣，細胞介導的免疫反應(yīng)比抗體介導的免疫反應(yīng)更重要。于是通常會認為結(jié)核桿菌存在胞內(nèi)不能與抗體結(jié)合，因此體液免疫反應(yīng)對結(jié)核感染的機體沒有保護作用。但是事實并非如此，抗體對于胞內(nèi)菌感染的作用越來越得到研究者們的關(guān)注，以期得到有關(guān)結(jié)核免疫機制的更深入理解。在抗結(jié)核的細胞免疫反應(yīng)中，主要參與的細胞是CD4+和CD8+T 細胞。巨噬細胞中結(jié)核桿菌通過MHCⅡ類分子的抗原提呈給CD4+T 細胞，被早期細胞因子如IL-12、IL-18 等誘導向Th1 型細胞分化。這種CD4+T細胞能夠產(chǎn)生大量的IFN-r等細胞因子，激活巨噬細胞，加速吞噬和殺滅結(jié)核桿菌。另外有研究說明CD4+T細胞還參與被感染的細胞的凋亡?？乖禺惖娜芗毎訡D4+T 細胞殺滅吞噬了結(jié)核桿菌的巨噬細胞，其中對細胞的溶解會導致細菌的擴散，但是釋放出的細菌又會被機體中的其他巨噬細胞吞噬，這樣形成的一個惡性循環(huán)；只有調(diào)節(jié)巨噬細胞和溶細胞性T 細胞活化之間平衡才能利于感染的控制?？偟膩碚f，CD4+T 細胞在機體抗結(jié)核感染起著重要作用，當例如HIV 感染的病人，缺乏CD4+T 細胞時，結(jié)核感染便不能控制。對于CD8+T細胞對結(jié)核感染的控制作用主要是產(chǎn)生顆粒溶素（granulysin）和穿孔素來直接殺滅結(jié)核桿菌；還有r/δT 細胞，在天然免疫和適應(yīng)性免疫起連接作用，其作用不僅僅是產(chǎn)生細胞因子和細胞毒性作用，還可以維持宿主細胞的完整性和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。另外還有些調(diào)節(jié)性T 細胞和單核細胞都能產(chǎn)生免疫抑制性的細胞因子TGF-β，可以被manLAM 刺激分泌增加，下調(diào)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，利于結(jié)核桿菌的生存。

A.7.2 免疫與超敏反應(yīng) 結(jié)核分枝桿菌所致免疫應(yīng)答的特點，是機體對結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生特異性免疫的同時，也產(chǎn)生了遲發(fā)型超敏反應(yīng)。隨著機體對結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生保護作用的同時，也可以看到有遲發(fā)型超敏反應(yīng)的產(chǎn)生，二者均為T細胞介導的結(jié)果。從郭霍現(xiàn)象（Koch phenomenon）可以看到，將結(jié)核分枝桿菌初次注入健康豚鼠皮下，10 d～14 d后局部潰爛不愈，附近淋巴結(jié)腫大，細菌擴散至全身，表現(xiàn)為原發(fā)感染的特點。若以結(jié)核分枝桿菌對以前曾感染過結(jié)核的豚鼠進行再感染 ，則于1 d～2 d內(nèi)局部迅速產(chǎn)生潰爛，易愈合。附近淋巴結(jié)不腫大，細菌亦很少擴散，表現(xiàn)為原發(fā)后感染的特點。可見再感染時潰瘍淺、易愈合、不擴散，表明機體已有一定免疫力。但再感染時潰瘍發(fā)生快，說明在產(chǎn)生免疫的同時有超敏反應(yīng)的參與。近年來研究表明結(jié)核分枝桿菌誘導機體產(chǎn)生免疫和超敏反應(yīng)的物質(zhì)不同。

A.7.3 免疫學檢測 1976年Bassau等首次用結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液，即PPD（結(jié)核菌素純蛋白衍生物）作抗原，以ELISA法檢測89例肺結(jié)核患者及48例正常人血清中的結(jié)核抗體敏感性為57%，特異性為98%。由于ELISA法簡便易行快速，且無需精密儀器，在結(jié)核病血清學診斷方面應(yīng)用最多應(yīng)用最廣。據(jù)報告ELISA法檢測結(jié)核抗體的敏感性為62.0%～94.7%，但結(jié)核分枝桿菌L型感染者OT或PPD實驗常呈陰性。目前可以采用免疫熒光法和膠乳凝集試驗檢驗,兩者在抗體稀釋度很高時，仍呈陽性反應(yīng)，這與非結(jié)核分枝桿菌L型或其他細菌 L型的表現(xiàn)明顯不同。

A.8 結(jié)核分枝桿菌的耐藥機制 目前對于結(jié)核桿菌耐藥機制的研究很多，但主要有以下3種觀點：細胞壁結(jié)構(gòu)與組成發(fā)生變化，使細胞壁通透性改變，藥物通透性降低，產(chǎn)生降解或滅活酶類，改變了藥物作用靶位；結(jié)核桿菌中存在活躍的藥物外排泵系統(tǒng)，外排泵將菌體內(nèi)藥物泵出，使得胞內(nèi)藥物濃度不能有效抑制或殺死結(jié)核桿菌，從而產(chǎn)生耐藥性；結(jié)核桿菌基因組上編碼藥物靶標的基因或藥物活性有關(guān)的酶基因突變，使藥物失效從而產(chǎn)生耐藥性，這是結(jié)核桿菌產(chǎn)生耐藥性的主要分子機制。

附錄B（規(guī)范性附錄）分枝桿菌細菌學檢查

B.1 痰標本的采集、運送和保存

B.1.1 痰標本的采集 采集步驟如下：

a) 即時痰為患者就診時深呼吸后咳出的痰液，清晨痰為清晨晨起立即用清水漱口后深咳出的痰液，夜間痰為送痰前一日夜間咳出的痰液；合格的痰標本應(yīng)是膿樣、干酪樣或膿性黏液樣性質(zhì)的痰液，痰量以 3 mL～5 mL 為宜。

b) 痰標本應(yīng)由檢驗人員或經(jīng)培訓合格的專人驗收，痰液不合格者，要求重新送檢；當難以獲得合格標本時，也應(yīng)進行細菌學檢查，但應(yīng)注明標本性狀，以便分析結(jié)果時參考。

c) 留取痰標本的容器應(yīng)采用國際通用螺旋蓋痰瓶，或選用直徑 40mm、高20mm 有螺旋蓋可密封的塑料盒，容器上應(yīng)注明患者姓名、編號、檢查項目、痰標本序號及送檢日期。

B.1.2 痰標本的運送 留取痰標本后，應(yīng)將容器密封，切勿倒置，以防痰液外溢；需外送檢查的標本應(yīng)認真核對痰盒上的 標注是否正確清晰，是否與檢驗單一致，痰容器應(yīng)采用專用的運輸盒運送。

B.1.3 痰標本的保存 當天不能檢查的痰標本應(yīng)置4℃冰箱內(nèi)保存。

B.2 萋-尼氏抗酸染色顯微鏡檢查

B.2.1 檢驗?zāi)康?檢測樣本中有無分枝桿菌，用于結(jié)核病的診斷。

B.2.2 方法原理 分枝桿菌的染色鏡檢可以使用不同的染料，但均是依據(jù)分枝桿菌細胞膜含脂質(zhì)較多，其中主要成分為分枝菌酸，菌酸具有抗酸性，染料將分枝桿菌染色后，分枝桿菌細胞膜能抵抗鹽酸乙醇等脫色劑作用，使分枝桿菌能保持染料的顏色。分枝桿菌抗酸性是菌體內(nèi)的分枝菌酸、RNA蛋白及其細菌壁的完整性相結(jié)合的綜合反應(yīng)，即抗酸性的強弱除與細菌壁的完整性有關(guān)以外，還與其細菌成熟和衰老程度有關(guān)。

萋-尼氏染色法，是復紅染色液在石炭酸的協(xié)同作用下，并對標本加熱促進染色劑同被染細胞的結(jié)合，將抗酸桿菌染成紫紅色，隨后使用酸性酒精脫色，抗酸桿菌能保持紫紅色，而其他脫落細胞或標本中的非抗酸桿菌被酸性酒精脫去顏色，后經(jīng)復染劑亞甲蘭復染為藍色，光學鏡下觀察，可在藍色背景下看到紫紅色的桿狀抗酸菌。

B.2.3 檢測樣品

B.2.3.1 痰

B.2.3.2 其他類型臨床標本 包括胸水、腹水、尿液、腦脊液、胃液、膿液（分泌物、穿刺液等）、病理組織或干酪塊、糞便和咽喉棉拭子、支氣管灌洗液等臨床標本。

B.2.3.3 分枝桿菌培養(yǎng)物 液體和固體分枝桿菌培養(yǎng)物（形態(tài)學鑒定）。

B.2.4 檢測設(shè)備儀器 生物安全柜、離心機、天平、高壓滅菌器、冰箱、顯微鏡、渦旋振蕩器。

B.2.5 檢測試劑材料及配制方法 材料如下：

a) 0.8%堿性復紅染液：

1) 堿性復紅乙醇儲存液：8 g 堿性復紅溶于95%酒精溶液 100 mL 中，充分振蕩使復紅溶解，避光保存。

2) 5%石碳酸水溶液：50℃水浴加熱溶解石碳酸，5 g 石碳酸溶于 90 mL 蒸餾水中，待溶液冷卻至室溫，補充蒸餾水至 100 mL。

3) 堿性復紅染色應(yīng)用液：10 mL 堿性復紅乙醇儲存液與 90 mL 5%石碳酸水溶液混合，用定性濾紙過濾。

b) 5%鹽酸乙醇脫色液：

35%濃鹽酸5 mL緩慢加入95%乙醇95 mL中混合。

c) 0.06%亞甲蘭復染液：

1) 亞甲蘭儲存液：0.3 g 亞甲蘭溶于 95%乙醇50 mL 中，完全溶解后加蒸餾水至終體積 100 mL；

2) 亞甲蘭復染液：以蒸餾水 5 倍稀釋 0.3%亞甲蘭儲存液，用定性濾紙過濾即得亞甲蘭復染液；

d) 磨砂載玻片、竹簽、2B 鉛筆、鏡油、染色架、玻片盒等。

B.2.6 操作步驟

B.2.6.1 涂片制備

B.2.6.1.1 直接涂片法，步驟如下：

a) 使用一端有磨砂面的無劃痕的新玻片，經(jīng)95%乙醇脫脂，干燥、清潔后備用；

b) 用 2B 鉛筆在磨砂面上注明實驗序號及標本序號；

c) 確保玻片的編號與痰盒上的編號相同；d) 生物安全柜中，小心打開承載痰標本的容器，防止產(chǎn)生氣溶膠或使標本外溢；

e) 仔細觀察標本，使用折斷的竹簽茬端，挑取痰標本中干酪樣、膿樣或可疑部分約 0.05 mL，于玻片正面輕輕環(huán)狀均勻涂抹成 10mm×20mm 的卵圓形痰膜（見圖 B.1）；

f) 痰膜朝上靜置在生物安全柜中，自然干燥后（一般約需要 30 min）進行染色鏡檢；

g) 涂抹完畢后的痰標本，在結(jié)果報告前應(yīng)暫時保留。

圖B.1 制備好的痰涂片示例

B.2.6.1.2 離心沉淀集菌涂片法 留取的痰標本，經(jīng)高壓蒸汽（1.0 kg/cm2，121℃ 15 min～20 min）液化和滅活處理，取出放冷后，取5 mL～10 mL盛于容積為50 mL的離心玻管中加滅菌蒸餾水20 mL～30 mL，振蕩器上振蕩5 min～10 min，在3 000 g離心15 min～30 min，使結(jié)核分枝桿菌集中于試管底部，取沉淀物涂片。

B.2.6.1.3 其他類型臨床標本，步驟如下：

a) 膿液：同痰液涂片；

b) 病理組織或干酪塊：先用組織研磨器研磨后再進行涂片；

c) 尿液：送檢標本應(yīng)首先靜置 2 h～4 h，取沉淀部分約 20 mL～50 mL，3 000 g 離心20 min～30 min，取沉淀涂片；

d) 胸、腹水標本：參照尿液涂片；

e) 腦脊液：無菌操作收集腦脊液，置冰箱或室溫 24 h，待薄膜形成后進行涂片；或?qū)⒛X脊液經(jīng) 3 000 g 離心 20 min～30 min，取沉淀涂片檢查；

f) 糞便：標本與生理鹽水混合后，充分振蕩使之成為混懸液；定性濾紙過濾后，濾液經(jīng) 3 000 g離心 20 min～30 min，沉淀進行涂片檢查；

g) 咽喉棉拭子：棉拭子放入無菌試管中，加入適量生理鹽水浸泡，并強烈振蕩，取出棉拭子后，液體在 3 000 g 離心 20 min～30 min，沉淀進行涂片檢查；

B.2.6.2 抗酸染色 步驟如下：

a) 固定：涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持 10mm 以上的距離；加熱固定（在5 s 內(nèi)將玻片經(jīng)過火焰加熱 4 次）。

b) 初染：滴加石碳酸復紅染液蓋滿痰膜，加熱至出現(xiàn)蒸氣后，停止加熱，保持染色 5 min。染色期間應(yīng)始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續(xù)加染色液。加熱時勿使染色液沸騰。高海拔地區(qū)應(yīng)適當增加加熱次數(shù)和染色時間。

c) 水洗：流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標本上剩余的水。

d) 脫色：自痰膜上端外緣滴加脫色劑蓋滿玻片，脫色 1 min；如有必要，流水洗去脫色液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為止。

e) 水洗：流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。

f) 復染：滴加亞甲藍復染液，染色 30 s。

g) 水洗：流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復染液，然后瀝去標本上剩余的水。待玻片干燥后鏡檢。

h) 效果：一張染色合格的玻片，痰膜肉眼觀為亮藍色，無紅色斑塊。

B.2.6.3 顯微鏡檢查 步驟如下：

a) 使用 10 倍目鏡雙目顯微鏡讀片。

b) 取染色完畢且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片臺上并以卡尺固定。

c) 首先使用40×物鏡，轉(zhuǎn)動卡尺移動玻片至痰膜左端，將光線調(diào)節(jié)至適當亮度，調(diào)節(jié)焦距至可見細胞形態(tài)。

d) 移開 40×物鏡，在玻片上滴 1～2 滴鏡油，使用100×油鏡進行細致觀察，應(yīng)避免油鏡鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。

e) 讀片時，首先應(yīng)從左向右觀察相鄰的視野，當玻片移動至痰膜一端時，縱向向下轉(zhuǎn)換一個視野，然后從右向左觀察，依此類推（見圖 B.2）。通常 20mm 的痰膜，使用 100×油鏡，每橫行約有 100 個視野。

f) 在淡藍色背景下，抗酸菌呈紅色，其他細菌和細胞呈藍色。

g) 仔細觀察完 300 個視野，一般需要 5 min以上，每個工作日，一位鏡檢人員的玻片閱讀量不應(yīng) 超過 25 張，且連續(xù)閱讀 10～12 張玻片后，應(yīng)休息 20 min 左右。

圖B.2 鏡檢讀片移動方式

B.2.7 結(jié)果判讀 萋-尼氏染色抗酸桿菌陰性：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；萋-尼氏染色抗酸桿菌陽性：抗酸桿菌菌數(shù)1～8條/300視野；萋-尼氏染色抗酸桿菌陽性（1+）：3～9條/100視野，連續(xù)觀察300個視野； 萋-尼氏染色抗酸桿菌陽性（2+）：1～9條/10視野，連續(xù)觀察100個視野； 萋-尼氏染色抗酸桿菌陽性（3+）：1～9條/1視野；萋-尼氏染色抗酸桿菌陽性（4+）：≥10條/1視野。

報告1+時至少觀察300個視野，報告2+至少觀察100個視野，3+、4+時至少觀察50個視野。

不典型抗酸菌（如：顆粒體、絲狀體、巨球體等），按實際觀察情況描述報告結(jié)果。例如：萋-尼氏染色陽性顆粒體（2＋）。

B.2.8 質(zhì)量控制 涂片鏡檢的質(zhì)量保證要按照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃·痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》要求的程序和頻度執(zhí)行。

B.3 熒光染色顯微鏡檢查

B.3.1 檢驗?zāi)康?檢測樣本中分枝桿菌，用于結(jié)核病的診斷。

B.3.2 方法原理 分枝桿菌在金胺“O”染液染色后，在含有紫外光源的熒光顯微鏡下發(fā)出橘黃顏色，高倍鏡（物鏡 40倍目鏡10倍）下，可見分枝桿菌產(chǎn)生黃綠色熒光，呈桿狀或分枝狀。

B.3.3 檢測樣品 同萋-尼氏抗酸染色。

B.3.4 設(shè)備儀器 熒光顯微鏡。

B.3.5 試劑材料

B.3.5.1 熒光染色液配制 材料如下：

a) 金胺“O”染液：

金胺“O” 1 g

石碳酸 50 mL

乙醇 100 mL

補蒸餾水至 1 000 mL

b) 脫色劑：5%鹽酸乙醇（配制方法參照萋－尼氏染色）；

c) 復染劑：0.5%高錳酸鉀水溶液。

B.3.5.2 涂片制備 同萋-尼氏抗酸染色法。

B.3.6 操作步驟

B.3.6.1 熒光染色 步驟如下：

a) 染色：涂片經(jīng)火焰固定后，滴加金胺“O”染色劑蓋滿玻片，染色 30 min，流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水；

b) 脫色：痰膜上端外緣滴加脫色劑，蓋滿玻片，脫色 3 min 或至無色，流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑；

c) 復染：加復染劑復染 1 min，瀝去復染液，流水自玻片一端輕洗，自然干燥后鏡檢。

B.3.6.2 顯微鏡檢查 有涂膜面向上放置玻片于熒光或LED顯微鏡載物臺，并以卡尺固定后，首先以10×目鏡、20×物鏡進行鏡檢，發(fā)現(xiàn)疑為分枝桿菌的熒光桿狀物質(zhì)，使用40×物鏡確認。在暗背景下，分枝桿菌發(fā)出黃色熒光，呈桿狀略彎曲。

B.3.7 結(jié)果判讀 熒光染色鏡檢結(jié)果分級報告標準：熒光染色分枝桿菌陰性 （-）：0條/50視野；熒光染色分枝桿菌陽性（報告分枝桿菌數(shù)）：1～9條/50視野；熒光染色分枝桿菌陽性（1+）：10～49條/50視野；熒光染色分枝桿菌陽性（2+）：1～9條/1視野； 熒光染色分枝桿菌陽性（3+）：10～99條/1視野； 熒光染色分枝桿菌陽性（4+）：100條及以上/1視野。報告2＋至少觀察50個視野，3+及以上的陽性結(jié)果至少觀察20個視野。

B.3.8 質(zhì)量控制 痰涂片應(yīng)保存近期3個月，年涂片量不足500張的實驗室痰涂片應(yīng)保存1年，3月痰涂片量超過1 000 張的，保存近期1 000張?zhí)低科?，供上級結(jié)核病實驗室（或質(zhì)量控制機構(gòu)）進行質(zhì)量控制復驗。

B.4 痰標本分枝桿菌固體培養(yǎng)基培養(yǎng)檢查

B.4.1 檢驗?zāi)康?分離臨床標本的分枝桿菌。

B.4.2 測定方法 目測法。

B.4.3 實驗原理 分枝桿菌因其較厚的細胞壁而具有耐受酸堿的特點，能耐受堿性消化液的處理，而酸性培養(yǎng)基能中和堿性標本處理液，堿消化液消化后標本可直接接種于酸性培養(yǎng)基上，用以分枝桿菌的分離培養(yǎng)。

B.4.4 標本要求

B.4.4.1 病人準備 不需要特殊準備。

B.4.4.2 標本類型 痰標本。

B.4.4.3 標本采集 具體步驟如下：

a) 當患者咳嗽、咳痰時，易產(chǎn)生含有結(jié)核分枝桿菌的氣溶膠，感染周邊人群的機率較高，故采集痰標本時應(yīng)在遠離人群的開放空間，或通風良好的留痰室內(nèi)進行；

b) 深吸氣2次～3次，每次用力呼出，從肺部深處咳出，將打開蓋的痰盒靠近嘴邊收集痰液，擰緊盒蓋；

c) 如果患者剛吃過東西，應(yīng)先用清水漱口，裝有義齒的患者在留取痰標本之前應(yīng)先將義齒取出；

d) 標本量：2 mL；

e) 不可接受樣本：唾液；

f) 標本儲存與標本穩(wěn)定性： 標本在2℃～8℃可保存5 d。

B.4.5 設(shè)備和試劑

B.4.5.1 設(shè)備 二級生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器。

B.4.5.2 試劑 前處理管（50 mL離心管）、無菌吸管（每份標本需要2支吸管：1支前處理吸標本，1支接種）、試管架、斜面培養(yǎng)架、培養(yǎng)管架、廢液缸（注意：內(nèi)盛不腐蝕高壓滅菌器的消毒液）、廢棄物袋。

4%氫氧化鈉（NaOH）溶液，酸性改良羅氏培養(yǎng)基。

B.4.6 操作程序

B.4.6.1 準備 具體準備如下：

a) 將酸性改良羅氏培養(yǎng)基從冷藏環(huán)境中取出，室溫下放置；

b) 接通生物安全柜電源，開風機保持預熱15 min；

c) 按照標本上的信息，將患者姓名或?qū)嶒炐蛱枠擞浽谇疤幚砉苌希?/p>

d) 待酸性改良羅氏培養(yǎng)基恢復至室溫，在培養(yǎng)管斜面的背面標記患者姓名、實驗序號、接種日期。

B.4.6.2 標本處理 具體步驟如下：

a) 對照標記的患者姓名，在生物安全柜內(nèi)使用無菌吸管吸取約2 mL標本于相應(yīng)標記的前處理管中；

b) 旋緊痰標本容器螺旋蓋；

c) 視痰標本性狀，使用吸管，將1倍～2倍痰標本體積的4% NaOH加入前處理管中；

d) 旋緊處理管螺旋蓋，將前處理管置于試管架內(nèi)；

e) 接通渦旋振蕩器電源，在生物安全柜內(nèi)將前處理管在渦旋振蕩器上渦旋振蕩30 s左右至痰標本液化；

f) 如果以手持拿前處理管，持拿方法是以拇指、無名指分別持拿處理管外壁，食指、中指按處理管螺旋蓋；

g) 將前處理管置于試管架內(nèi)，置于生物安全柜內(nèi)，室溫靜置15 min。

B.4.6.3 接種 具體步驟如下：

a) 擰開酸性改良羅氏培養(yǎng)管螺旋蓋，檢查培養(yǎng)基斜面底部的冷凝水，如果冷凝水過多，則沿著斜面相對的一面的培養(yǎng)管內(nèi)壁，將冷凝水棄去；

b) 以無菌吸管吸取前處理后的痰標本，吸取接近結(jié)束時，將吸管口移出液面，使吸管前端一段不含液體，避免液體意外滴落；

c) 保持培養(yǎng)基斜面水平或底端略低，均勻接種至酸性改良羅氏培養(yǎng)基斜面上，每支培養(yǎng)基使用接種2滴（0.1 mL～0.15 mL），接種時第一滴液體接種至斜面中部，第二滴接種到培養(yǎng)基上部；

d) 將用過的吸管置于生物安全柜內(nèi)的廢液缸內(nèi)；

e) 旋上培養(yǎng)管螺旋蓋，不要太緊；

f) 輕輕轉(zhuǎn)動并放低培養(yǎng)管底部，使接種的液體均勻的在斜面上鋪開；

g) 將培養(yǎng)基放置在斜面培養(yǎng)架上，保持培養(yǎng)基斜面水平向上；

h) 重復步驟a)～g)，直至全部培養(yǎng)基接種完畢。

B.4.6.4 觀察報告 具體步驟如下：

a) 將接種后的培養(yǎng)基連同斜面培養(yǎng)架置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，36℃±1℃孵育；

b) 24 h后，再擰緊培養(yǎng)管螺旋蓋，放置于直立的培養(yǎng)管架上，36℃±1℃條件下繼續(xù)孵育；

c) 接種后第3天和第7天觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察一次，直至第8周末。每次觀察后要在培養(yǎng)結(jié)果記錄本上記錄觀察結(jié)果。

B.4.7 結(jié)果判讀 結(jié)核桿菌的典型菌落形態(tài)為：不透明淡黃色、粗糙、干燥、凸起于培養(yǎng)基、有的成菜花樣。如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基液化、或者長霉菌，則報告污染。

分枝桿菌分級報告標準：

無菌落生長 報告培養(yǎng)陰性

菌落生長不及斜面面積1/4時，報告實際菌落數(shù)

菌落占斜面面積 1/4 報告（1+）

菌落占斜面面積1/2 報告（2+）

菌落占斜面面積3/4 報告（3+）

菌落布滿培養(yǎng)基斜面 報告（4+）

B.4.8 質(zhì)量控制 參照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》進行質(zhì)量控制。

附錄C（規(guī)范性附錄）結(jié)核病病理學檢查

C.1 結(jié)核病病理學特征 病理學改變表現(xiàn)為上皮細胞樣肉芽腫性炎，光學顯微鏡下可見大小不等和數(shù)量不同的壞死性和非壞死性的肉芽腫。肉芽腫是由上皮樣細胞結(jié)節(jié)融合而成。典型的結(jié)核病變由融合的上皮樣細胞結(jié)節(jié)組成，中心為干酪樣壞死，周邊可見郎罕多核巨細胞，外層為淋巴細胞浸潤和增生的纖維結(jié)締組織。證明結(jié)核性病變，需要在病變區(qū)找到病原菌。組織病理學通常可采用抗酸染色方法。切片染色后顯微鏡下常?？梢栽趬乃绤^(qū)中心或壞死區(qū)與上皮樣肉芽腫交界處查見紅染的兩端鈍圓并稍彎曲的短棒狀桿菌；用金胺羅達明熒光染色，在熒光顯微鏡下也可查見桿菌。利用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)能對石蠟包埋組織中結(jié)核桿菌DNA進行檢測并與其他抗酸桿菌相鑒別。對一些陳舊性結(jié)核病變，僅有凝固性壞死和纖維化病變，在抗酸染色未找到結(jié)核桿菌情況下，應(yīng)用PCR對結(jié)核桿菌DNA檢測，敏感性和特異性高，對于確定診斷有較好幫助。

C.2 臨床病理學診斷

C.2.1 穿刺物涂片檢查 穿刺物涂片檢查是利用細針穿刺，吸取病變部位的少量體液及細胞標本，通過對穿刺物涂片行萋- 尼（Ziehl-Neelsen）氏抗酸染色法染色、鏡檢查找抗酸陽性桿菌,方法簡便易行，結(jié)果較為可靠，廣泛應(yīng)用于臨床。

C.2.2 活檢組織病理學診斷 結(jié)核分枝桿菌引起慢性感染屬于特殊性炎癥，可引起細胞免疫反應(yīng)和IV型變態(tài)反應(yīng)，具備一般炎癥的滲出、壞死和增生3種基本變化，亦有其特殊性，詳見如下：

a) 滲出性病變：主要表現(xiàn)為漿液性或漿液纖維素性炎。病變早期局部有中性粒細胞浸潤，但很快被巨噬細胞所取代，在滲出液和巨噬細胞中可查見結(jié)核桿菌。

b) 增生性病變：形成具有診斷價值的結(jié)核結(jié)節(jié)，由上皮樣細胞、郎罕多核巨細胞以及外周聚集的 淋巴細胞和少量增生的纖維母細胞構(gòu)成，典型者結(jié)節(jié)中央有干酪樣壞死。

c) 變質(zhì)性病變：上述以滲出為主或以增生為主的病變均可繼發(fā)干酪樣壞死，結(jié)核壞死灶由于含脂質(zhì)較多呈淡黃色、均質(zhì)細膩，質(zhì)地較實，狀似奶酪，故稱干酪樣壞死。干酪樣壞死對結(jié)核病病理診斷具有一定的意義。顯微鏡下為紅染無結(jié)構(gòu)的顆粒狀物，干酪樣壞死物中常見少數(shù)結(jié)核桿菌。滲出、壞死和增生 3 種變化往往同時存在而以某一種改變?yōu)橹?，而且可以互相轉(zhuǎn)化。

典型結(jié)核（結(jié)核結(jié)節(jié)）的病理診斷較容易，而不具備典型結(jié)核病理變化的病例則常需借助抗酸染色找到結(jié)核桿菌從而明確診斷。多數(shù)結(jié)核病灶特別是干酪樣壞死組織中及其周圍組織內(nèi)可查到結(jié)核桿菌。 還可采用現(xiàn)代分子生物學檢測手段，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR法）、原位雜交和基因測序等作輔助診斷。盡管如此，仍有少數(shù)病例可能因組織取材以及處理不當?shù)纫蛩夭荒苊鞔_診斷，還需參考臨床表現(xiàn)、結(jié)核菌素試驗、影像學及診斷性治療等才能明確診斷。

附錄D（規(guī)范性附錄）結(jié)核菌素皮膚試驗

D.1 結(jié)核菌素皮膚試驗方法 在左前臂掌側(cè)前1/3中央皮內(nèi)注射5 IU PPD，以局部出現(xiàn)7mm～8mm大小的圓形橘皮樣皮丘為宜。

D.2 查驗反應(yīng) 72 h（48 h～96 h）檢查反應(yīng)。以皮膚硬結(jié)為準。

陰性（-）：硬結(jié)平均直徑＜5mm或無反應(yīng)者為陰性。

陽性反應(yīng)（+）：硬結(jié)平均直徑≥5mm者為陽性。硬結(jié)平均直徑≥5mm，＜10mm為一般陽性；硬結(jié)平均直徑≥10mm，＜15mm為中度陽性；硬結(jié)平均直徑≥15mm或局部出現(xiàn)雙圈、水泡、壞死及淋巴管炎者為強陽性。

D.3 結(jié)核菌素皮膚試驗的假陰性反應(yīng) 結(jié)核菌素皮膚試驗假陰性反應(yīng)如下：

a) 變態(tài)反應(yīng)前期：從結(jié)核分枝桿菌感染到產(chǎn)生反應(yīng)約需一個多月，在反應(yīng)前期，結(jié)核菌素試驗無反應(yīng)；

b) 免疫系統(tǒng)受干擾：急性傳染病，如百日咳、麻疹、白喉等，可使原有反應(yīng)暫時受到抑制，呈陰性反應(yīng)；

c) 免疫功能低下：重癥結(jié)核病、腫瘤、結(jié)節(jié)病、艾滋病等結(jié)素反應(yīng)可降低或無反應(yīng)，但隨著病情好轉(zhuǎn)，結(jié)核菌素試驗可又呈陽性反應(yīng)；

d) 結(jié)核菌素試劑失效或試驗方法錯誤，也可出現(xiàn)結(jié)核菌素試驗陰性。

D.4 結(jié)核感染判斷標準 判讀結(jié)核感染標準如下：

a) 一般情況下，在沒有卡介苗接種和非結(jié)核分枝桿菌干擾時，PPD反應(yīng)硬結(jié)≥5mm應(yīng)視為已受結(jié)核菌感染；

b) 在卡介苗接種地區(qū)和或非結(jié)核分枝桿菌感染流行地區(qū)，以PPD反應(yīng)≥10mm為結(jié)核感染標準；

c) 在卡介苗接種地區(qū)和或非結(jié)核分枝桿菌流行地區(qū)，對HIV陽性、接受免疫抑制劑＞1個月，PPD 反應(yīng)≥5mm為結(jié)核感染；

d) 與涂片陽性肺結(jié)核有密切接觸的5歲以下兒童，PPD反應(yīng)≥5mm為結(jié)核感染；

e) PPD反應(yīng)≥15mm及以上或存在水泡、壞死、淋巴管炎等為結(jié)核感染強反應(yīng)。

附錄E（資料性附錄）肺結(jié)核鑒別診斷、非結(jié)核分枝桿菌肺病

E.1 肺結(jié)核鑒別診斷

E.1.1 影像呈浸潤表現(xiàn)的肺結(jié)核鑒別 影像呈浸潤表現(xiàn)的肺結(jié)核應(yīng)與細菌性肺炎、肺真菌病和肺寄生蟲病等感染性肺疾病相鑒別。細菌性肺炎常有受涼史，多伴血白細胞升高，抗感染治療病灶吸收較快；肺真菌病常有長期應(yīng)用抗生素、免疫抑制劑或患有免疫疾病史，痰真菌培養(yǎng)陽性，血G試驗及GM試驗陽性，抗炎、抗結(jié)核治療無效，抗真菌治療有效；肺寄生蟲病患者常有在流行地區(qū)居住史，食污染食物及飲生水史，痰內(nèi)或胸水查到蟲卵，血清特異性抗體檢查有助于診斷。

E.1.2 肺結(jié)核球鑒別 肺結(jié)核球與周圍性肺癌、炎性假瘤、肺錯構(gòu)瘤和肺隔離癥等相鑒別。周圍性肺癌患者常以咳嗽、胸痛就診或體檢發(fā)現(xiàn)病灶，病灶多有分葉、毛刺，多無衛(wèi)星病灶，患者痰中可找到瘤細胞，經(jīng)皮肺穿刺活檢或經(jīng)支氣管鏡肺活檢病理檢查常能確診；炎性假瘤是一種病因不明炎性肉芽腫病變，患者以前曾有慢性肺部感染史，抗炎治療病灶逐漸縮??；肺錯構(gòu)瘤常為孤立病灶，呈爆米花樣陰影；肺隔離癥以20歲年輕人較多，不伴肺內(nèi)感染時可長期無癥狀，病變好發(fā)于肺下葉后基底段，以左下肺多見，密度均勻、邊緣清楚，很少鈣化，血管造影及肺放射性核素掃描可見單獨血供，可確診。

E.1.3 血行播散性肺結(jié)核鑒別 血行播散性肺結(jié)核與支氣管肺泡細胞癌、肺含鐵血黃素沉著癥和彌漫性肺間質(zhì)病相鑒別。肺泡細胞癌患者多無結(jié)核中毒癥狀，胸悶、氣短癥狀明顯，可以有較多泡沫樣痰液，病灶多發(fā)生于雙肺中下肺野，分布不均勻，痰中檢查可查到癌細胞，經(jīng)皮肺活檢、經(jīng)支氣管鏡肺活檢常能確診；肺含鐵血黃素沉著癥患者常有反復咳嗽、咯血及缺鐵性貧血癥狀，有過敏、二尖瓣狹窄、肺出血-腎炎綜合征等病史，陰影中下肺野分布較多，患者痰巨噬細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)含鐵血黃素顆?？芍\斷，確診通常依靠經(jīng)皮肺組織活檢或經(jīng)支氣管鏡肺活檢病理檢查；彌漫性肺間質(zhì)病患者病史較長，進行性呼吸困難，部分患者有粉塵接觸史，陰影以中下肺野、內(nèi)中帶較多，患者未并發(fā)感染時，多無發(fā)熱，低氧血癥明顯，確診通常需肺活檢病理檢查。

E.1.4 支氣管淋巴結(jié)結(jié)核鑒別 支氣管淋巴結(jié)結(jié)核與中央型肺癌、淋巴瘤和結(jié)節(jié)病相鑒別。肺癌患者年齡多在40歲以上，患者早期可有刺激性干咳、血痰，多無結(jié)核中毒癥狀；淋巴瘤為淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤，可表現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)肺門淋巴結(jié)腫大，患者多伴血色素降低、淺表部位淋巴結(jié)腫大；結(jié)節(jié)病是原因不明的全身性肉芽腫疾病，影像學表現(xiàn)雙側(cè)肺門或縱隔淋巴結(jié)腫大，結(jié)核菌素試驗多為陰性，Kveim試驗陽性，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶升高，腎上腺皮質(zhì)激素治療有效，以上疾病確診通常需支氣管鏡檢查或超聲內(nèi)鏡檢查并病理檢查。

E.1.5 肺結(jié)核空洞鑒別 肺結(jié)核空洞與癌性空洞、肺囊腫和囊性支氣管擴張相鑒別。肺癌性空洞洞壁多不規(guī)則，空洞內(nèi)可見結(jié)節(jié)狀突起，空洞周圍無衛(wèi)星灶，空洞增大速度較快；肺囊腫為肺組織先天性異常，多發(fā)生在肺上野，并發(fā)感染時，空腔內(nèi)可見液平，周圍無衛(wèi)星灶，未并發(fā)感染時可多年無癥狀，病灶多年無變化；囊性支氣管擴張多發(fā)生在雙肺中下肺野，患者常有咳大量膿痰、咯血病史，薄層CT掃描或碘油支氣管造影可助診斷。

E.1.6 結(jié)核性胸膜炎鑒別 結(jié)核性胸膜炎與各種漏出性胸腔積液、癌性胸腔積液和肺炎旁胸腔積液相鑒別。胸腔積液診斷的一項必要工作是鑒別是滲出液（來自侵及胸膜的疾病或?qū)е卵芡ㄍ感栽黾雍?或胸腔淋巴回流減少的疾病）還是漏出液（起因與正常胸膜系統(tǒng)胸內(nèi)流體靜力壓和膠體滲透壓的紊亂），其鑒別目前仍采用Light標 準檢測胸液（PF）、血清乳酸脫氫酶（LDH）和總蛋白。如果符合下列一項或多項標準，胸液可能是滲出性的：

a) PF的蛋白/血清蛋白比值＞0.5；

b) PF的LDH/血清LDH比值＞0.6；

c) PF的LDH＞2/3正常血清LDH上限。

胸腔積液脂質(zhì)和膽固醇的測量一般用于懷疑乳糜胸或假性乳糜胸的診斷。當胸腔積液總甘油三酯（TG）＞110 mg/dL，胸腔積液TG/血清TG＞1，胸腔積液膽固醇/血清膽固醇＜1時，可診斷乳糜胸。胸腔積液TG＜50 mg/dL可排除乳糜胸的診斷。心源性胸腔積液、肝性胸腔積液和腎性胸腔積液，臨床上積液多為雙側(cè)，有原發(fā)病病史，無結(jié)核中毒癥狀，胸水密度1.016，蛋白含量＜30 g/L，通常為漏出液，原發(fā)病好轉(zhuǎn)后胸水很快吸收。腫瘤胸膜轉(zhuǎn)移及胸膜間皮瘤，患者常有劇痛，胸水多為血性，胸水瘤細胞及胸膜活檢特別是胸腔鏡下直視活檢病理檢查可助診斷。肺炎旁胸腔積液患者有感染史，抗感染治療后胸水很快吸收。

E.1.7 肺結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌肺病鑒別 非結(jié)核分枝桿菌肺病臨床表現(xiàn)酷似肺結(jié)核病。多繼發(fā)于支氣管擴張、矽肺和肺結(jié)核病等慢性肺病，也是人類免疫缺陷病毒（HIV）感染或獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）的常見并發(fā)癥。常見臨床癥狀有咳嗽、咳痰、咯血、發(fā)熱等。胸片可表現(xiàn)為炎性病灶及單發(fā)或多發(fā)薄壁空洞，纖維硬結(jié)灶、球形病變及胸膜滲出相對少見。病變多累及上葉的尖段和前段。但亦約有20%～50%的病人無明顯癥狀。痰抗酸染色涂片檢查陽性，無法區(qū)別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，只有通過分枝桿菌培養(yǎng)菌型鑒別方可鑒別。其病理組織學基本改變類似于結(jié)核病，但非結(jié)核分枝桿菌肺病的組織學上改變以類上皮細胞肉芽腫改變多見，無明顯干酪樣壞死。膠原纖維增生且多呈現(xiàn)玻璃樣變，這是與結(jié)核病的組織學改變區(qū)別的主要特點。目前尚無特效治療非結(jié)核分枝桿菌肺病的化學藥物和標準的化療方案，且多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物耐藥，故主張抗結(jié)核藥物與其他抗生素聯(lián)合使用，方案中藥物以3種～5種為宜，一般情況下，非結(jié)核分枝桿菌肺病在抗酸桿菌陰轉(zhuǎn)后仍需繼續(xù)治療18個月～24個月，至少12個月，與肺結(jié)核化療方案 明顯不同。

E.2 非結(jié)核分枝桿菌肺病

E.2.1 非結(jié)核分枝桿菌（NTM）定義 NTM指除結(jié)核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的其他分枝桿菌總稱。NTM感染指感染了NTM，但未發(fā)病；NTM病指感染了NTM，并引起相關(guān)組織、臟器的病變。

E.2.2 NTM分離培養(yǎng)和菌種鑒定方法 NTM分離培養(yǎng)和菌種鑒定方法包括以下幾種：

a) 傳統(tǒng)方法：包括液體和固體培養(yǎng)基培養(yǎng)；

b) 高效液相色譜法；

c) 分子生物學方法。

E.2.3 NTM肺病的臨床表現(xiàn) NTM病的全身中毒癥狀和局部損害表現(xiàn)與結(jié)核病相似，在無菌種鑒定結(jié)果的情況下，可長期被誤診為結(jié)核病。女性患病率明顯高于男性，老年人居多。大多數(shù)患者肺部已有基礎(chǔ)疾病，如COPD、支氣管擴張癥、囊性纖維化、塵肺病、肺結(jié)核和肺泡蛋白沉著癥等?；颊叩呐R床表現(xiàn)差別較大，有的人沒有明顯癥狀，由體檢發(fā)現(xiàn)；有的人已進展到肺空洞，病情嚴重；多數(shù)人發(fā)病緩慢，常表現(xiàn)為慢性肺部疾病的惡化，也可有急性發(fā)?。豢捎锌人?、咳痰、咯血、胸痛、氣急、盜汗、低熱、乏力、消瘦和萎靡不振等癥狀。

X線胸片顯示炎性病灶及單發(fā)或多發(fā)的薄壁空洞，而纖維硬結(jié)灶、球形病變及胸膜滲出相對少見。病變多累及上葉尖段和前段。胸部CT，尤其是高分辨CT可清楚顯示NTM肺病的肺部病灶，可有結(jié)節(jié)影、斑片及小斑片樣實變影、空洞（尤其是薄壁空洞）影、支氣管擴張、樹芽征、磨玻璃影、線狀及纖維條索影、胸膜肥厚粘連等表現(xiàn)，且通常以多種形態(tài)病變混雜存在。由于NTM病程較長、肺組織破壞較重及并發(fā)癥的存在，一般NTM肺病患者的肺通氣功能減退較肺結(jié)核更為明顯。

E.2.4 NTM肺病的診斷

E.2.4.1 NTM感染 NTM皮膚試驗陽性以及缺乏組織、器官受到NTM侵犯的依據(jù)，符合上述條件者即可診斷為NTM感染。

E.2.4.2 疑似NTM病 符合以下條件之一即可考慮為疑似NTM?。?/p>

a) 痰抗酸桿菌檢查陽性而臨床表現(xiàn)與肺結(jié)核不相符者；

b) 痰液顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)菌體異常的分枝桿菌；

c) 痰或其他標本中分枝桿菌培養(yǎng)陽性，但其菌落形態(tài)和生長情況與MTB復合群有異；

d) 接受正規(guī)抗結(jié)核治療無效而反復排菌的患者，且肺部病灶以支氣管擴張、多發(fā)性小結(jié)節(jié)及薄壁空洞為主；

e) 經(jīng)支氣管衛(wèi)生凈化處理后痰分枝桿菌不能陰轉(zhuǎn)者；

f) 有免疫功能缺陷，但已除外肺結(jié)核的肺病患者；

g) 醫(yī)源性或非醫(yī)源性軟組織損傷，或外科術(shù)后傷口長期不愈而找不到原因者。

E.2.4.3 NTM肺病 具有呼吸系統(tǒng)癥狀和(或)全身癥狀，經(jīng)胸部影像學檢查發(fā)現(xiàn)有空洞性陰影、多灶性支氣管擴張及多發(fā)性小結(jié)節(jié)病變等，已排除其他疾病，在確保標本無外源性污染的前提下，符合以下條件之一者可做出 NTM肺病的診斷：

a) 痰NTM培養(yǎng)2次均為同一致病菌；

b) 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中NTM培養(yǎng)陽性1次，陽性度為++以上；

c) BALF中NTM培養(yǎng)陽性1次，抗酸桿菌涂片陽性度為++以上；

d) 經(jīng)支氣管鏡或其他途徑的肺活組織檢查，發(fā)現(xiàn)分枝桿菌病的組織病理學特征性改變（肉芽腫性炎癥或抗酸染色陽性），并且NTM培養(yǎng)陽性；

e) 肺活組織檢查發(fā)現(xiàn)分枝桿菌病的組織病理學特征性改變（肉芽腫性炎癥或抗酸染色陽性），并且痰標本和（或）BALFNTM培養(yǎng)陽性≥1次。

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R511.1

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1007-8134(2017)06-000Ⅰ-12

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.06.001