晶狀體上皮細(xì)胞(lens endothelial cells,LECs)在晶狀體細(xì)胞的生長(zhǎng)和衰老過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用，與白內(nèi)障的起因和發(fā)展過(guò)程息息相關(guān)。LECs的這種行為通過(guò)許多的細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行分子調(diào)節(jié)[1，2]。色素上皮來(lái)源因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是一種在人體內(nèi)廣泛存在的細(xì)胞因子。前人研究表明PEDF和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)有拮抗作用[3，4]。在人的房水和LECs中PEDF的水平與人體衰老和白內(nèi)障的發(fā)病程度有正相關(guān)性[5-7]。但是，PEDF是否對(duì)LECs的生長(zhǎng)起調(diào)節(jié)作用，以及相關(guān)的分子機(jī)制還未有報(bào)道。本文著力于闡明PEDF對(duì)LECs生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用以及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的相關(guān)分子機(jī)制研究。

資料與方法

一、對(duì)象

82例(82只眼)白內(nèi)障患者的納入準(zhǔn)則：(1)年齡52～92歲；(2)非先天性白內(nèi)障，非代謝性白內(nèi)障，非繼發(fā)性白內(nèi)障；(3)眼底病變、葡萄膜炎、青光眼；(4)無(wú)眼外傷和眼內(nèi)手術(shù)史；(5)晶狀體前囊混濁；(6)無(wú)其他晶狀體混濁，除非與年齡有關(guān)的晶狀體混濁。

晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3培養(yǎng)：完全培養(yǎng)基+10%胎牛血清，80%密度時(shí)胰酶消化，傳代和凍存。

二、方法

1.RT-PCR檢測(cè)PEDF mRNA表達(dá)：白內(nèi)障摘除術(shù)，獲取晶狀體上皮細(xì)胞，接種在培養(yǎng)瓶中。HE染色后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)密度，分為低密度組(<4000/mm2)和高密度組(>4500/mm2)，每組20例。利用RT-PCR試劑盒提取晶狀體囊膜組織中RNA并合成cDNA。PEDF和β-actin的引物設(shè)計(jì)如表1。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)擴(kuò)增mRNA，分析電泳圖及擴(kuò)增片段，計(jì)算PEDF和mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 PEDF和β-actin引物

2.Annexin V法檢測(cè)LECs增殖和凋亡：加PEDF實(shí)驗(yàn)組：DMEM完全培養(yǎng)基+10%FBS+50ng/ml PEDF，培養(yǎng)72 h。不加PEDF對(duì)照組：DMEM完全培養(yǎng)基+10%FBS。采用annexin V-FITC/7-AAD復(fù)染法檢測(cè)兩組的細(xì)胞周期和凋亡情況。

重懸收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，0.5×106～1×106，一管細(xì)胞懸液中加100 μl緩沖液和100 μl Annexin V-FITC避光孵育，另一管細(xì)胞懸液中加400 μl緩沖液和5 μl 7-ADD溶液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況。不加Annexin V-FITC和7-AAD的重懸細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VEGF和mRNA表達(dá)情況：采用Trizol Reagent試劑盒提取兩組重懸細(xì)胞的RNA，VEGF引物如表2，擴(kuò)增片段大小166 bp，內(nèi)參β-actin 161 bp，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s；40 cycles。

表2 VEGF引物

三、數(shù)據(jù)分析

利用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，測(cè)量的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，采用t檢測(cè)進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組的LECs密度及PEDF mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平比較

高密度組的LECs密度顯著高于低密度組的LECs密度(P<0.001)，PEDF的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，高密度組顯著高于低密度組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 兩組的LECs密度及PEDF mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平比較

二、加PEDF干預(yù)后LECs的增殖和凋亡結(jié)果

加PEDF實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞在培養(yǎng)24、48和72 h后光學(xué)顯微鏡下觀察，與對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。加PEDF實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)72 h后，G2和S期的細(xì)胞比率遠(yuǎn)高于對(duì)照組(P<0.001)，凋亡率顯著低于對(duì)照組(P<0.001)。上述結(jié)果表明PEDF對(duì)HLE-B3細(xì)胞的凋亡具有一定的抑制作用。見(jiàn)圖1和表4。

表4 加PEDF培養(yǎng)組和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率和G2+S期的細(xì)胞比率

三、VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

加PEDF實(shí)驗(yàn)組VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，相對(duì)表達(dá)降低了75.3%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。見(jiàn)表5。

表5 VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

討 論

PEDF基因和表達(dá)蛋白廣泛分布于成人的眼內(nèi)視網(wǎng)膜、睫狀體、角膜、脈絡(luò)膜中[8-10]。有研究稱(chēng)人體內(nèi)PEDF主要是保護(hù)視網(wǎng)膜及促進(jìn)分化作用[11，12]。Hermann等人通過(guò)相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)PEDF具有抑制血管異常增生的作用[13]。Golan等發(fā)現(xiàn)鼠眼的晶狀體上皮細(xì)胞存在PEDF的表達(dá)[14]。Huang等應(yīng)用cDNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出人眼晶狀體上皮細(xì)胞中PEDF基因，并證明其與白內(nèi)障的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)[15]。但目前還沒(méi)有研究指出PEDF和LECs的增殖有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果表明當(dāng)LECs處于低密度時(shí)，PEDF水平也降低。通過(guò)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，證明PEDF能夠抑制LECs的凋亡，并降低VEGF表達(dá)。作為和細(xì)胞周期相關(guān)的細(xì)胞因子，PEDF是一種在G0期反應(yīng)細(xì)胞增殖能力的特定基因[16-18]。有報(bào)道稱(chēng)PEDF在一些和年齡有關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展中有一定的作用[19]。

圖1 LECs的增殖和凋亡情況

本研究以人的晶狀體上皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，探究了PEDF在LECs中的作用。結(jié)果表明PEDF具有抑制LECs凋亡，減少VEGF表達(dá)的作用。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，在晶狀體的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，PEDF的作用可通過(guò)自分泌，旁分泌，抗腫瘤，抗氧化，抗血管再生的刺激發(fā)揮出來(lái)。本研究可以為晶狀體的生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程，甚至是白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程提供進(jìn)一步的指導(dǎo)作用。

[1] Suen WL, Chau Y. Specific uptake of folate-decorated triamcinolone-encapsulating nanoparticles by retinal pigment epitheliumcells enhances and prolongs antiangiogenic activity. J Control Release，2013，167: 21-28.

[2] Beckman SA, Chen WC, Tang Y,et al. Beneficial effect of mechanical stimulation on the regenerative potential of muscle-derived stem cells is lost by inhibiting vascular endothelial growth factor. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013，33:2004-2012.

[3] Soejima K, Shinoda K, Kashimura T,et al. Wound dressing material containing lyophilized allogeneic cultured cells. Cryobiology，2013，66:210-214.

[4] Szymanska J, Goralczyk K, Klawe JJ, et al. Phototherapy with low-level laser influences the proliferation of endothelial cells and vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-beta secretion. J Physiol Pharmacol，2013，64:387-391.

[5] Astern JM, Collier AC, Kendal-Wright CE. Pre-B cell colony enhancing factor (PBEF/NAMPT/Visfatin) and vascular endothelial growth factor (VEGF) cooperate to increase the permeability of the human placental amnion. Placenta，2013，34:42-49.

[6] Perspicace E, Jouan-Hureaux V, Ragno R, et al. Design, synthesis and biological evaluation of new classes of thieno pyrimidinone and thieno triazine as inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2). Eur J Med Chem，2013，63:765-781.

[7] Yamben IF, Rachel RA, Shatadal S,et al. Scrib is required for epithelial cell identity and prevents epithelial to mesenchymal transition in the mouse. Dev Biol，2013，384:41-52.

[8] Rachitskaya AV, Goldhardt R. Retinal pigment epithelium Tear. Curr Ophthal Rep，2015，3:26-33.

[9] Young M, Chui L, Fallah N,et al.Exacerbation of choroidal and retinal pigment epithelial atrophy after anti-vascular endothelial growth factor. Retina，2014，34:1308-1315.

[10] Dithmer M, Fuchs S, Shi Y, et al.Fucoidanreduces secretion and expression of vascular endothelial growth factor in the retinal pigment epithelium and reduces angiogenesis in vitro. PLoS One，2014，9：89150.

[11] Hazama T, Fukami K, Yamagishi S,et al. Dialysate vascular endothelial growth factor is an independent determinant of serum albumin levels and predicts future withdrawal from peritoneal dialysis in uremic patients. Ther Apher Dial，2014，18:391-397.

[12] Dahrouj M, Alsarraf O, Mcmillin JC, et al. Vascular endothelial growth factor modulates the function of the retinal pigment epithelium in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci，2014，55:2269-2275.

[13] Hermann MM, Van Asten F, Muether PS, et al. Polymorphisms in vascular endothelial growth factor receptor 2 are associated with better response rates to ranibizumab treatment in age-related macular degeneration.Ophthalmology，2014，121:905-910.

[14] Golan S, Entin-Meer M, Semo Y,et al. Gene profiling of human VEGF signaling pathways in human endothelial and retinal pigment epithelial cells after anti VEGF treatment. Bmc Res Notes，2014，7:617.

[15] Huang LY, Zhou XY. Effect of adenovirus-mediated slit2 shRNA on hypoxia-induced expression of vascular endothelial growth factor in human retinal pigment epithelial cells. Chin J Biol，2014，27:361-370.

[16] Yi JW, Lee WS, Kim SB,et al. Effect of zoledronate on the expression of vascular endothelial growth factor-a by articular chondrocytes and synovial cells: an in vitro study. J Bone Metab，2014， 21:249-255.

[17] Liegl R, Koenig S, Siedlecki J,et al. Temsirolimus inhibits proliferation and migration in retinal pigment epithelial and endothelial cells via mTOR inhibition and decreases VEGF and PDGF expression. PLoS One，2014， 9：88203.

[18] Aldebasi YH, Rahmani AH, Khan AA,et al.The effect of vascular endothelial growth factor in the progression of bladder cancer and diabetic retinopathy. Int J Clin Exp Med，2013，6:239-251.

[19] Kim KJ, Yun JH, Heo JI,et al. Role of pigment epithelium-derived factor in the involution of hemangioma: autocrine growth inhibition of hemangioma-derived endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun，2014，454:282-288.