李 慧, 張雅文, 羅翔宇, 賴天斌, 李海航

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室, 珍稀動物研究與開發(fā)中心, 廣州 510631; 2. 廣州匯川醫(yī)藥科技有限公司, 廣州 510410)

人工養(yǎng)殖鱷魚油的提取與精制工藝研究

李 慧1,2, 張雅文1,2, 羅翔宇1,2, 賴天斌2, 李海航1*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室, 珍稀動物研究與開發(fā)中心, 廣州 510631; 2. 廣州匯川醫(yī)藥科技有限公司, 廣州 510410)

以人工養(yǎng)殖的鱷魚脂肪為材料，根據(jù)傳統(tǒng)淡堿水解工藝的提取原理，采用淡堿水解-乙醇萃取方法，對鱷魚油的提取和精制工藝進行優(yōu)化，并用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析檢測精制鱷魚油成分，結(jié)果顯示：用優(yōu)化后的工藝制備鱷魚油，精制油得率達(dá)75%，色素和腥臭味得到有效脫除； 鱷魚油中含 25 種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含量占油脂總量的65.4%，不含鉛、汞、砷等重金屬. 該方法簡單、高效，制備成本低，適合大量提取制備.

鱷魚油； 淡堿水解-乙醇萃取； 脂肪酸； 提取精制工藝

鱷魚是2億多年前與恐龍同時代的、最古老的肉食性卵生脊椎類兩棲爬行動物，是迄今生存著的最原始的動物之一. 鱷魚全身都是寶，鱷魚皮可制作高級皮革，鱷魚肉有很高的營養(yǎng)價值和保健功能. 我國從1993年開始引進外來鱷種進行大量養(yǎng)殖，國家林業(yè)局于2003年批準(zhǔn)尼羅鱷(Crocodylusniloticus)、灣鱷(Crocodyluspotosus)和暹羅鱷(Crocodylussiamensis)列入首批54種可商業(yè)化經(jīng)營利用的野生動物名錄. 我國現(xiàn)有鱷類養(yǎng)殖單位約140家，外來鱷魚養(yǎng)殖場57個. 但鱷魚的規(guī)?；庸ず唾Y源綜合開發(fā)利用還停留在初步研究階段[1].

鱷魚體內(nèi)粗脂肪含量為3.5%～7.0%[2]，鱷魚油含不飽和脂肪酸高達(dá)71.5%，其中主要為亞油酸和花生四烯酸. 鱷魚油脂肪酸組成有深海魚油的特點，二十碳五烯酸(Eicosopentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA，)含量較高. 本草綱目記載，鱷魚油脂主治皮膚病和惡瘡，是最好的防凍防寒油[3]，還具有抗菌、抗炎[4]、促進皮膚燒傷愈合[5]等作用，已廣泛應(yīng)用于化妝品、防凍傷和消炎等藥品及保健產(chǎn)品.

鱷魚油提取和精制的報道較少. FOLCH等[6]采用有機溶劑提取鱷魚油，此法僅限于實驗室的少量制備，不適用于批量生產(chǎn). 林珈好等[7]對超臨界流體萃取法和干法熬制提取鱷魚油進行了比較，結(jié)果表明，超臨界流體萃取法提取率低，為32.6%；干法熬制雖然提取率較高，但高溫加熱使油脂的結(jié)構(gòu)遭到破壞. 關(guān)于鱷魚油精制工藝，李華亮等[8]開發(fā)了一種去腥除臭工藝，包括磷酸脫膠、堿煉脫酸、真空加熱脫臭以及吸附脫色等多個步驟；宇海銀等[9]使用硅膠-中草藥吸附法對鱷魚油進行脫臭，將鱷魚油用有機溶劑溶解后，進行柱層析分離. 2種工藝均操作復(fù)雜，且用中草藥吸附臭味物質(zhì)的同時，有可能向鱷魚油中引入其他成分. 目前仍缺乏有效的大量提取和精制鱷魚油的工藝方法.

動物油脂的提取方法主要有熬制法、蒸煮法[10]、溶劑法[11]、酶解法[12]、超臨界流體萃取法[13]和淡堿水解法[14]等. 淡堿水解法是利用稀堿水溶液水解脂肪組織中的蛋白質(zhì)，使與蛋白結(jié)合的油脂解離出來，是魚油提取工業(yè)中常用的方法[15]，具有出油率高、產(chǎn)品色澤淺、游離脂肪酸含量少等特點[16]. 本實驗改進了傳統(tǒng)的淡堿水解法，采用淡堿-乙醇萃取法對鱷魚油提取精制工藝進行優(yōu)化，重點考察對難以除去的色素和腥臭味的脫除效果.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

實驗材料：暹羅鱷的腹部脂肪，由廣州匯川醫(yī)藥科技有限公司的海南省萬寧鱷魚養(yǎng)殖場提供. 取鱷魚新鮮或冷凍保存的腹部脂肪，用40～50 ℃溫水洗去表面血跡，除去血管和粘膜等非脂肪組織、瀝干，在組織搗碎機中搗碎成脂肪糜備用.

實驗試劑：95%乙醇為食品級，其他試劑為分析純，均購于本地試劑公司.

脂肪酸成分分析儀器：7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司).

1.2 鱷魚油的粗提取

1.2.1 鱷魚油提取工藝流程 鱷魚脂肪8 g →料液比1∶1加入淡堿-乙醇溶液提取→NaCl鹽析分離→鱷魚粗油→乙醇萃取→60 ℃蒸餾水洗滌→離心→灌裝.

1.2.2 pH對鱷魚油提取效果的影響 用1 mol/L的氫氧化鈉溶液分別配制pH為7.0、8.0、9.0、10.0的淡堿溶液作為提取溶劑，計算得油率，比較不同pH對鱷魚油提取效果的影響，得到提取溶劑的最佳pH.

得油率(%)=油質(zhì)量(g)/原料質(zhì)量(g)×100%

1.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對鱷魚油提取效果的影響 配制乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、80%的淡堿-乙醇溶液作為提取溶劑，以無乙醇的淡堿-乙醇溶液為對照，比較不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對鱷魚油提取效果的影響，得到最佳乙醇體積分?jǐn)?shù).

1.2.4 提取溫度對鱷魚油提取效果的影響 以得到的最佳pH和乙醇體積分?jǐn)?shù)配制提取溶劑，比較提取溫度分別為60、70、80、90℃時對得油率的影響.

1.2.5 不同提取時間對鱷魚油提取效果影響 用得到最佳提取溶劑，90 ℃水浴加熱提取10～90 min，5 000 g 離心10 min，分離油相，計算得油率，得到最佳提取時間.

1.2.6 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈉和鹽析時間對鱷魚油提取效果的影響 在鱷魚油的淡堿水解法得到的提取液中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 和4% 氯化鈉，時間為5、10、15 min, 鹽析后5 000 g離心10 min，分離油相，計算得油率. 確定最佳鹽析條件.

1.3 鱷魚油的精制

1.3.1 工藝流程 100 g粗油(預(yù)熱至60 ℃)→100 mL乙醇萃取2次→60 ℃蒸餾水洗滌3次→離心→灌裝(加抗氧化劑，充氮氣)

1.3.2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇和pH對鱷魚油精制效果的影響 分別用體積分?jǐn)?shù)40%、60%、80%、95%,pH 3.0、6.0、9.0的乙醇溶液對鱷魚油粗提物進行萃取，根據(jù)脫色脫臭效果和得油率確定最佳精制工藝.

1.4 鱷魚油主要指標(biāo)測定

外觀和氣味：感官判斷酸值測定：參照GB/T 5530-2005.

酸值：稱取20 g油脂，用熱乙醇溶解油脂，氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，滴定過程中要充分搖動，至溶液顏色發(fā)生變化，并且保持15 s不褪色，即為滴定終點. 記錄滴定終點時氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液用量，計算酸值:

酸值=56.1Vc/m，

其中:V為所用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；c為所用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確濃度(mol/L)；m為試樣的質(zhì)量(g)；56.1為氫氧化鉀的摩爾質(zhì)量 (g/mol).

過氧化值測定：參照GB/T 5538-2005. 稱取4 g油脂，用50 mL乙酸-異辛烷溶液溶解. 加入0.5 mL飽和碘化鉀溶液，反應(yīng)1 min±1 s后，立即加入30 mL蒸餾水. 上述溶液用硫代硫酸鈉溶液攪拌滴定. 滴定至溶液黃色接近消失，添加0.5 mL淀粉溶液繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，即為終點. 記錄硫代硫酸鈉溶液用量，計算過氧化值:

過氧化值(mmol/kg)=1000(V-V0)c/2m，

其中：V為測定的硫代硫酸鈉溶液的體積(mL)；V0為空白的硫代硫酸鈉溶液的體積(mL)；c為硫代硫酸鈉溶液的濃度(mol/L)；m為試樣的質(zhì)量(g).

精制鱷魚油成分分析：精制鱷魚油的脂肪酸組成及重金屬由廣州分析測試中心測定.

2 結(jié)果與分析

2.1 鱷魚油的粗提取

鱷魚油得油率隨pH的升高而提高(圖1A)，當(dāng)pH≥9.0時，鱷魚油得率不再增加. 在pH 9.0和pH 10.0時，鱷魚油的提取率均達(dá)到76%～77%. 為確保油脂的充分提取，后續(xù)實驗淡堿提取液pH為10.0. 與對照組相比，含有乙醇的淡堿提取液有利于油脂的提取(圖1B). 乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%和50%的溶液作為提取溶劑，油脂提取率達(dá)到83.7%，比對照高7%. 而體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液較40%和50%，得油率有所下降. 因此，后續(xù)實驗選用pH 10.0、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇淡堿溶劑做為水解法提取鱷魚油的提取溶劑.

以pH 10.0、50%乙醇淡堿溶液溶液作為提取溶劑，分別測定在60、70、80、90 ℃下油脂的得油率，結(jié)果如圖1C所示. 各溫度下油脂的得油率均達(dá)80% 以上，但60～80 ℃下提取的油脂較混濁，90 ℃ 提取的油脂為澄清的黃色液體，易與提取液分離. 因此，確定鱷魚油的提取溫度為90 ℃.

圖1D可知，90℃下提取10 min，提取率達(dá)80%以上. 延長提取時間對鱷魚油的提取率無影響. 確定提取時間為10 min.

在得到的鱷魚油淡堿水解液中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%和4%氯化鈉進行鹽析(圖1E)，實驗組粗油得率均為83%～84%，與對照組相比無顯著差異. 但對照組油水界面不清晰，給后面的萃取和分離帶來的困難. 加入1%或4%氯化鈉后，油水界面清晰. 因此，選擇加入1%氯化鈉進行鹽析.

比較了鹽析時間對油脂提取的影響(圖1F),鹽析時間為5、10、15 min，油脂提取率為80%～81%， 不同的鹽析時間得油率無顯著差異. 因此，選擇鹽析時間為5 min.

圖1 提取溶劑pH(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(E)、鹽析時間(F)對鱷魚油得油率的影響

Figure 1 Effects of pH (A), ethanol concentration (B) of the hydrolysis solution, extraction temperature (C), extraction time (D), NaCl amount (E), and time for salting out the oil (F) on the yield of crocodile oil

2.2 鱷魚油的精制

分別用體積分?jǐn)?shù)40%、60%、80%、95%的乙醇溶液萃取粗油脫色脫臭，在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%～80%內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，脫色脫臭效果越好. 體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液萃取效果最好(表1). 當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加至95% 時，脫色脫臭效果與體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇無顯著差異，得油率較其他實驗組有所增加，但萃取后的油脂有明顯的乙醇?xì)馕?

體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液調(diào)pH至 3.0、6.0和9.0，對油脂進行萃取，結(jié)果表明，堿性乙醇的脫色脫臭效果最佳(表1). 考慮到油脂在堿性條件下可能發(fā)生水解，導(dǎo)致油脂的損失，選擇pH 9.0、體積分?jǐn)?shù)80% 的乙醇溶液對粗油進行脫色脫臭. 按料液比(m∶V)為1∶1,對粗油萃取1～3次，萃取1次后的鱷魚油呈淺黃色，仍有淡魚腥味；萃取2次即可得到微黃色、無魚腥味的鱷魚油. 因此，選擇pH 9.0、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液按V(乙醇)∶m(粗油)為1∶1的比例對粗油萃取2次，用等量蒸餾水洗滌3次，最后通過離心使油水完全分離，得到的鱷魚油為微黃色，無腥臭味. 精制鱷魚油加入0.2%的維生素E，灌裝，充氮氣，于4 ℃ 避光密封保存.

2.3 精制鱷魚油感官評價和理化指標(biāo)測定

對精制鱷魚油的外觀和氣味進行評價，測定酸值和過氧化值，并與精制魚油一級標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 3502-2000)進行比較. 結(jié)果表明(表2),精制鱷魚油為微黃色，無腥臭味、無酸敗味，符合精制魚油一級標(biāo)準(zhǔn). 精制鱷魚油的酸值為(0.08±0.01) mg/g，過氧化值為0 mmol/kg，遠(yuǎn)低于精制魚油一級標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限度值，表明精制鱷魚油的品質(zhì)超過了一級魚油標(biāo)準(zhǔn).

表1乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH和萃取次數(shù)對粗鱷魚油脫色脫臭效果的影響

Table 1 Effects of ethanol concentration, pH and fractionation times on decoloration and deodorization of crude crocodile oil

處理工藝得油率/%色澤、氣味乙醇體積分?jǐn)?shù)/%4093．4±1．11深黃色，腥臭味較濃6093．2±0．93深黃色，腥臭味較濃8093．4±0．80黃色，淡腥臭味9594．6±0．40黃色，淡腥臭味pH393．5±0．27黃色，淡腥臭味693．9±1．47黃色，淡腥臭味992．9±1．09淺黃色，淡腥臭味萃取次數(shù)198．9±0．27淺黃色，淡腥臭味298．1±0．44微黃色，無腥臭味397．7±0．92微黃色，無腥臭味

表2 精制鱷魚油與一級精制魚油的比較Table 2 Comparison of refined crocodile oil with the standard of first-grade refined fish oil

在脂肪糜和精制鱷魚油中分別中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的維生素E，按優(yōu)化工藝提取精制，測定所得油脂的酸價，脂肪糜、對照組(無維生素E添加)及實驗組的油脂酸值分別為0.465、0.079、0.028 mg/g. 實驗組的酸值較對照組明顯降低，說明添加抗氧劑有助于鱷魚油抗氧化，提高了油脂品質(zhì).

表3精制鱷魚油的脂肪酸組成及重金屬含量測定

Table 3 Fatty acid profile and heavy metal content of refined crocodile oil

名稱相對含量/%名稱相對含量/%十二酸0．41二十碳一烯酸2．00十三酸0．06二十碳二烯酸0．30十四酸2．16二十碳三烯酸0．63十五酸1．21二十碳四烯酸1．00十六酸24．48二十碳五烯酸0．24十六碳一烯酸7．03二十二碳三烯酸0．33十七酸0．44二十二碳四烯酸0．53十七碳一烯酸0．18二十二碳五烯酸0．58十八酸5．72二十二碳六烯酸1．25油酸36．30鉛未檢出亞油酸14．54汞未檢出二十酸0．15砷未檢出亞麻酸0．46

GC-MS對精制油的成分進行分析，結(jié)果見表3. 精制鱷魚油含25種脂肪酸，不飽和脂肪酸含量為65.4%，其中單不飽和脂肪酸占45.5%，多不飽和脂肪酸占19.9%，精制油中未檢出鉛、汞、砷等重金屬物質(zhì). 結(jié)果表明，該鱷魚油提取與精制工藝可制備高品質(zhì)鱷魚油.

3 分析與討論

本實驗研究了淡堿水解法提取鱷魚油的pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間等對提取效果的影響. pH是影響油脂提取的重要因素[17]，實驗首先優(yōu)化了淡堿溶液的pH. 實驗證明，鱷魚油提取率隨pH的升高而提高. 進一步探究了提取溶劑對油脂提取的影響，結(jié)果表明，淡堿-乙醇溶液更有利于油脂的提取. 而且，提取溶劑中含有乙醇能同時萃取油脂中的游離脂肪酸等雜質(zhì)，提高粗油的品質(zhì)，有利于后續(xù)的除雜精制. 但乙醇體積分?jǐn)?shù)太高會造成油脂的損失，80%乙醇溶液提取時，粗油得率有所下降. 90 ℃下提取10 min，鱷魚油已被充分提取，提取率達(dá)80%以上. 延長提取時間對鱷魚油的提取率無影響. 為避免油脂在長時間加熱下發(fā)生水解，確定提取時間為10 min. 加入氯化鈉對鱷魚油的提取率無顯著影響，但鹽析后的油水界面清晰. 這與文獻[18]報道的結(jié)果一致，氯化鈉可破壞組織殘渣和皂化物等雜質(zhì)形成的乳膠體，使油澄清. 通過優(yōu)化提取工藝 ，鱷魚油得油率達(dá)到83.8%±0.9%，較文獻報道[7]的提高了23.7%.

鱷魚油的精制包括除去粗油中的游離脂肪酸、膠質(zhì)、色素和腥臭味成分等雜質(zhì). 本實驗證實高體積分?jǐn)?shù)的乙醇有助于油脂脫色脫臭，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過高可能增加其與油脂的互溶，使油脂中殘留的乙醇增加.

水產(chǎn)品的腥臭味限制了其在食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用. 文獻[19]報道，不飽和脂肪酸的氧化是導(dǎo)致鱷魚油腥味的重要因素. 闕婷婷等[20]分析暹羅鱷腥味成分，認(rèn)為是脂肪分解后產(chǎn)生的小分子醛類物質(zhì)共同作用構(gòu)成了較濃的腥味. 因此，提取、精煉過程中油脂的抗氧化十分重要. 因此實驗在提取精制過程中加入維生素E作為抗氧劑，有效地保護了油脂，提高了油脂品質(zhì).

4 結(jié)論

本實驗建立了淡堿水解-乙醇萃取法從人工養(yǎng)殖的鱷魚脂肪中提取和制備高品質(zhì)鱷魚油的最佳工藝： 新鮮或冷凍保存的暹羅鱷腹部脂肪，用溫水清洗,打碎成脂肪糜，按料液比1∶1(m∶V)加入pH10.0、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的維生素E，90 ℃下攪拌提取10 min后，加入1%氯化鈉鹽析5 min，離心得粗鱷魚油. 粗鱷魚油按V(乙醇)∶m(粗油)為1∶1，用pH 9.0的80%乙醇萃取2次，除去有機雜質(zhì)；再用蒸餾水洗3次，離心得鱷精制魚油. 該工藝操作簡單，適用于工業(yè)上大量制備油脂.

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QUE T T,XIE Y,ZHENG J W,et al. Analysis of nutritional and odor components in muscle of Siam alligator (Crocodylussiamensis) [J]. Journal of Zhejiang University (Agriculture & Life Sciences),2013,39(2):122-132.

Study on the Extraction and Refinement of the Oil from Cultured Crocodile

LI Hui1,2, ZHANG Yawen1,2, LUO Xiangyu1,2, LAI Tianbin2, LI Haihang1*

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences and R & D Center for Rare Animals, South China Normal University, Guangzhou 510631; 2. Guangzhou Huichuan Medicinal Technology Ltd., Guangzhou 510410)

In this study, we established a mild alkali-ethanol extraction method for the extraction and refinement of crocodile oil from cultured crocodile fat. The refined oil was obtained at a yield of 75% of the fat materials, without unfavorable and fishy smell; GC-MS analysis indicated that the refined oil contains 25 kinds of fatty acid and the unsaturated fatty acids accounted for 65.4% of oil, and is free of lead, mercury and arsenic. This work provides a simple and efficient method for large-scale preparation of high quality crocodile oil.

crocodile oil; mild alkali-ethanol extraction; fatty acids; extraction and refinement method

2016-08-18 《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

2015年中央農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣項目(粵農(nóng)財2015, No. 60-43)；廣東省科技計劃項目(項目編號2014A010107026)

*通訊作者:李海航，教授，Email:li8341@163.com.

Q819

A

1000-5463(2017)06-0071-06

【中文責(zé)編：成文；助理編輯：冷佳奕 英文審校：李海航】

·簡訊· 《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》被評為“廣東省精品科技期刊”

2017年12月14—15日，廣東省科學(xué)技術(shù)期刊編輯學(xué)會第六次會員代表大會暨學(xué)會成立20周年慶祝大會在廣東省恩平市召開，會上舉行了“第六屆廣東省精品、優(yōu)秀、特色科技期刊”的評選及表彰活動. 在這次評選活動中，共評出精品期刊19種、優(yōu)秀期刊31種、特色科技期刊32種. 《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》被評為“精品科技期刊”.

近年來，《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》通過刊發(fā)我?！案咚酱髮W(xué)重點學(xué)科群”稿件，吸引校外優(yōu)質(zhì)稿源，使刊物的影響得到較大提高. 據(jù)《中國學(xué)術(shù)期刊影響因子年報(自然科學(xué)與工程技術(shù))》統(tǒng)計，《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》的期刊影響力指數(shù)由2016年的114.837上升到2017年的246.206，復(fù)合影響因子由2016年的0.489上升到2017年的0.686，期刊綜合類影響因子由2016年的0.344上升到2017年的0.450.