穆一帆， 鐘廣炎， 高 峰*， 鐘 云， 胡敏倫， 閆化學， 姜 波， 吳 波

(1. 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，華南師范大學生命科學學院，廣州 510631；2. 廣東省農業(yè)科學院果樹研究所，廣州 510640)

NPR1和Defensin雙價抗病基因過量表達載體構建及其對沙田柚的遺傳轉化

穆一帆1， 鐘廣炎2*， 高 峰1*， 鐘 云2， 胡敏倫2， 閆化學2， 姜 波2， 吳 波2

(1. 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，華南師范大學生命科學學院，廣州 510631；2. 廣東省農業(yè)科學院果樹研究所，廣州 510640)

通過PCR技術，從克里曼丁橘和荔枝品種“三月紅”葉片中克隆獲得了NPR1和Defensin基因序列. 以pBI-121作為載體骨架，構建了NPR1和Defensin雙價抗病基因過量表達載體，命名為ND-pBI121. 通過根癌農桿菌介導的遺傳轉化，獲得了6株PCR檢測為陽性的雙抗沙田柚植株, 為探究NPR1和Defensin基因的過量表達對柑橘黃龍病的抗性影響提供試材.

抗病基因； 過表達載體； 柑橘黃龍??； 遺傳轉化； 沙田柚

柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)是一種由革蘭氏陰性細菌引起的植物病害，病株果實常表現為青果，果汁味酸、淡，果實中心柱不正[1]. 此外，病株的種子質量減輕，多敗育且萌發(fā)率降低[2]. 隨著近年來柑橘黃龍病在全球范圍內的爆發(fā)，對該病的防治受到了廣泛的關注，但目前尚無有效的防治方法[3]. 黃龍病病原菌不能分離純化培養(yǎng)的特性對該病的研究和防治造成了嚴重的阻礙[4]，傳統的防治方法：培育無毒苗、鏟除病樹、防控木虱，無法從根本上解決黃龍病的爆發(fā)[5]. 因此，抗性育種材料的篩選和培育至關重要[6]，遠緣植物中抗性基因的利用可望為黃龍病的防治提供一條新的途徑.

病程相關非表達子1(Nonexpressor of Pathogenesis Related Genes 1,NPR1)具有廣譜抗性，在植物系統獲得抗性(Systemic Acquired Resistance,SAR)、誘導系統抗性(Induced Systemic Resistance, ISR)中起核心調控作用，是多種抗病途徑中的關鍵節(jié)點[7]. CAO等[8]發(fā)現，缺失NPR1基因的擬南芥突變植株對各種SAR誘導物不能做出應答反應，同時對病原微生物感染的敏感性顯著提高. 隨后在不同植物物種中克隆得到了NPR1基因及其同源基因，并且證實NPR1基因能增強水稻[9]和玉米[10]等作物的抗病能力.

植物防御素(Defensin)是植物體在受到病原體侵染時所產生的一種拮抗物質，是一類富含半胱氨酸的小分子多肽，對細菌等微生物具有廣譜抗性[11]. 來源不同的植物防御素的抗菌作用機制與抗菌廣譜性不盡相同，其抗菌作用機制主要有2種：一種機制是與細胞膜上的脂類相互作用，誘導細胞膜結構和通透性改變的[12-13], 從而導致細胞膜結構的改變，原生質體的泄露和電化學勢的失衡；一種機制是與細胞內的復合物結合，該方式的作用機制還有待研究[14].

2015年DUTT等[15]發(fā)現，導入擬南芥NPR1基因的甜橙轉基因植株對黃龍病的抗性增強. 此外，對已經分離得到的植物防御素(Defensin)進行分類的研究發(fā)現，部分Defensin能夠抑制革蘭氏陰性細菌的生長[16]. 有研究[17]表明，荔枝鮮有革蘭氏陰性菌引起的病害發(fā)生，據此推測荔枝對細菌侵染性疾病具有一定的抗性. 本實驗擬采用基因工程技術構建柑橘NPR1和荔枝Defensin雙價抗病基因過量表達載體并轉化柑橘柚類優(yōu)良品種“沙田柚”，為探究NPR1和Defensin基因的過量表達對柑橘黃龍病的抗性影響提供試材及技術基礎.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗材料：克里曼丁橘(CitrusreticulataBlanco cv. Clementine)葉片，取自廣東省農業(yè)科學院果樹研究所；荔枝(LitchichinensisSonn.)，品種“三月紅”的葉片，分別作為提取基因組DNA的材料；沙田柚(Critrusgrandis(L.) Osbeck cv. Shatianyou)果實購自廣東梅龍柚果股份有限公司，作為遺傳轉化受體.

實驗試劑：Ex Taq酶、PrimeSTARMax Premix、PCR純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA Marker、ClonExpressII One Step Cloning Kit試劑盒、購于TaKaRa生物工程有限公司. BamH I、Sac I限制性內切酶購自NEB公司. 植物DNA提取試劑盒購自東盛生物技術有限公司. 用于載體構建的連接載體pBI-121和大腸桿菌菌株DH5α的感受態(tài)細胞、卡納霉素(Kanamycin，Kan)、利福平(Rifampin，Rif)、鏈霉素(Streptomycin，Str)購于北京全式金生物技術有限公司. 用于啟動子克隆的pFGC5941載體購于瑞真生物工程有限公司.

實驗儀器：電泳系統(ATTO，AE-6111)；PCR儀(Biometra)；凝膠成像系統(UVP，LMS-26E)；

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA的提取 按照DNA快速提取試劑盒的說明書提取柑橘品種“克里曼丁橘”和荔枝品種“三月紅”的葉片總DNA，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，保存于-20 ℃冰箱中備用.

1.2.2 引物的設計與合成 分別從在線網站http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php中下載得到甜橙NPR1基因序列(ctNPR1)；從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載菠菜Defensin基因序列，與荔枝品種“三月紅”的基因組序列比對，得到一段同源序列并命名為DF-1；從NCBI網站中下載pBI-121載體編碼序列，以及pFGC5941載體上的啟動子(35S-PR)和終止子(TER-1)序列. 利用Primer 5設計NPR1、TER-1、35S-PR、DF-1等4個片段的特異性擴增引物(表1). 根據ClonExpressII One Step Cloning Kit試劑盒提供的連接方法，在ctNPR1的正向引物與DF-1的反向引物中的5′端分別引入線性化克隆載體酶切位點末端序列，使得插入片段的PCR產物5′和3′最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應的完全一致的序列 (15～20 bp)，再按照上述4個片段的排列順序分別在各片段正向引物的5′端添加前一個片段的3′端同源序列(15～20 bp)，反向引物的5′端添加后一個片段的5′端同源序列，引物序列由生工生物工程有限公司合成.

表1 基因克隆及轉基因植株檢測所用引物Table 1 Primers used for gene cloning and detection of transgenic plants

1.2.3 目的片段的擴增及測序 分別以克里曼丁橘總DNA、pFGC5941載體、荔枝“三月紅”總DNA為模板，利用上述引物擴增進行第一輪擴增，得到ctNPR1(1784 bp)、TER-1(738 bp)、35S-PR(1343 bp)與DF-1(313 bp) DNA片段. 反應體系25 μL，其中模板DNA 1 μL，正反擴增引物各1 μL，Prime STAR Max Premix12.5 μL，然后加雙蒸水補足至25 μL， PCR擴增程序：94 ℃ 下預變性3 min；94 ℃變性10 s，63 ℃退火10 s，72 ℃ 延伸20 s，循環(huán)34次；72 ℃延伸3 min. 反應產物用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測. 以第1輪的4段擴增產物為模板，以ctNPR1 F作為上游引物，DF-1 R作為下游引物進行第2輪擴增，利用各片段兩端的重復序列連接4個DNA片段. 反應同樣采用25 μL體系，連接后的目的片段理論長度為4 119 bp. 在偱環(huán)儀上進行擴增. 第2輪反應產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇與目的片段大小一致的條帶進行膠回收，所得PCR產物與膠回收產物測序.

1.2.4 ctNPR1和DF-1雙價抗病基因過量表達載體的構建及農桿菌轉化 經BamH1和Sac1雙酶切的載體pBI-121在電泳后將載體骨架從膠中回收、純化. 連接測序后的目的片段和線性化載體，獲得ctNPR1和DF-1雙價抗病基因過量表達載體，命名為ND-pBI121. 用ND-pBI121轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，在含有Kan的LB平板上培養(yǎng). 正常生長的陽性克隆菌斑經PCR檢測后，在含有Kan的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，抽提質粒. 所得質粒經目的基因特異引物ctNPR1(F/R)PCR鑒定為陽性后，將重組質粒用化學法轉入根癌農桿菌EHA105，在含有Kan、Rif、Str的LB平板上培養(yǎng)，所得克隆菌斑進行PCR陽性鑒定，用于沙田柚的遺傳轉化.

1.2.5 ND-pBI121在沙田柚幼苗中的遺傳轉化 將沙田柚上胚軸斜切成1～2 cm小段的外植體用于農桿菌轉染，農桿菌轉染柑橘上胚軸具體的方法步驟參考貝學軍[18]和胡新喜等[19]的方法. 上胚軸愈傷組織分化出的抗性再生芽長到2 cm，并在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至葉片顏色深綠后用于嫁接. 待嫁接成活的幼芽長出5～6片幼葉時，取新生葉片提取總DNA，使用引物ctNPR1 F、DF-1 R進行PCR檢測.

2 結果與分析

2.1 目的片段的擴增與連接

以甜橙總DNA、pFGC5941載體、三月紅荔枝總DNA為模板，通過第1輪PCR擴增出ctNPR1(1 784 bp)、TER-1 (738 bp)、35S-PR(1 343 bp)與DF-1 (313 bp) DNA片段，經凝膠電泳檢測，獲得條帶大小與預測條帶大小一致(圖1A). 以第1輪PCR擴增產物為模板，擴增出一條大小約為4 000 bp的條帶(圖1B)，目的片段預測為4 119 bp，基本符合，將其進行膠回收并純化后測序，測序結果與該片段的預期序列進行比對，結果基本一致，僅在35S啟動子的非保守區(qū)域有個別堿基錯配發(fā)生，對目的片段的表達并無影響.

圖1 目的片段擴增及連接產物的電泳結果

Figure 1 Electrophoresis analysis of target fragments (A) amplified from the ligated product (B)

注：M為DL5000 DNA marker.

2.2 ctNPR1和DF-1雙價抗病基因過量表達載體的構建

用限制性內切酶BamHⅠ、SacⅠ對載體pBI-121進行雙酶切，得到2個片段，分別為大小約為12 000 bp的載體骨架序列和大小約為2 000 bp的小片段(圖2A)，符合預期大小. 將pBI-121骨架序列回收后與目的片段根據同源重組的方法連接為重組質粒并轉化大腸桿菌. 獲得的陽性克隆使用基因特異引物ctNPR1(F/R)PCR檢測驗證后進行菌液培養(yǎng)，提取質粒，再次進行PCR驗證，結果與預期相符(圖2B)，表明已成功獲得ctNPR1和DF-1雙價抗病基因過量表達載體，命名為ND-pBI121.

2.3 根癌農桿菌工程菌及擬轉基因植株獲得

圖2 線性化載體與農桿菌陽性鑒定的電泳結果

Figure 2 Linearized pBI 121 vector (A) and identification of positive transformed Agrobacterium (B)

注：M1為DL5000 DNA marker，M2為DL2000 DNA marker，CK1為未酶切的pBI-121載體，CK2為陰性對照.

圖3 ND-pBI121農桿菌菌液的PCR檢測及擬轉基因植株

Figure 3 PCR detection of ND-pBI121 Agrobacterium liquid and transgenic plant

注： M1為DL5000 DNA marker，1～4為隨機挑選的EHA105菌斑菌液PCR的結果，“+”為陽性對照，“-”為陰性對照.

將重組質粒ND-pBI121用化學法轉入根癌農桿菌EHA105，獲得過量表達ctNPR1和DF-1的農桿菌工程菌，隨機挑選4～5個菌斑進行菌液PCR檢測，其檢測結果均為陽性(圖3A). 表明已成功獲得轉入ND-pBI121表達載體的農桿菌菌株. 將沙田柚幼苗的上胚軸與PCR檢測結果為陽性的根癌農桿菌共培養(yǎng)，一共獲得了7株抗性芽(分別編號為ND1～ND7). 將抗性芽嫁接至沙田柚的砧木，成活后獲得了擬轉基因植株(圖3B).

2.4 沙田柚轉基因植株的鑒定

用7株擬轉基因植株葉片提取總DNA進行PCR檢測，引物為ctNPR1 F、DF-1 R，結果顯示ND1～ND5和ND7為陽性(圖4). 說明，這6株為導入了ctNPR1和DF-1基因的轉基因植株.

圖4 擬轉基因沙田柚植株的PCR檢測

注：M為DL5000 DNA marker，“-”為陰性對照，“+”為陽性對照.

3 討論

筆者成功構建了ctNPR1和DF-1雙價抗病基因的過量表達載體ND-pBI121，并導入大腸桿菌中保存. 經PCR檢測為陽性后，轉入根癌農桿菌. 通過根癌農桿菌介導的遺傳轉化，獲得了6株經PCR檢測證實為陽性的沙田柚轉基因植株. 本實驗的結果將為探究ctNPR1和DF-1的過量表達對柑橘黃龍病的抗性影響提供理想試材.

由于單個抗病基因選擇性抑菌以及抗病譜窄等原因，很難獲得效果理想的轉基因植株，為提高轉基因植物的廣譜抗病性和持久性，更好地抵御不同病害，就需要同時轉入一個以上具有廣譜抗性的抗病基因[20]. 已有實驗證明，擬南芥的NPR1基因可使柑橘對黃龍病的抗性提高，但是提高的程度并不顯著，無法起到明顯的防治效果[15]，因此嘗試多基因的導入模式對柑橘的抗黃龍病分子育種具有重大意義. 本文選擇來源于柑橘的NPR1基因和來源于抗病性較強的荔枝的Defensin基因為操作對象，構建獲得了雙價抗病基因過量表達載體，以期獲得能夠更加有效的抵抗黃龍病的柑橘品種.

后續(xù)試驗中需要擴大培養(yǎng)，獲得更多轉基因植株，并對獲得的轉基因植株進行黃龍病抗性評價，同時與單一轉入柑橘NPR1基因的沙田柚植株進行對比，以驗證多基因導入模式的可行性，為在分子層面探究如何增強柑橘對黃龍病的抗性提供了更多的可能. 這在柑橘產業(yè)的健康發(fā)展受到黃龍病嚴重影響的大環(huán)境下，對防治黃龍病、加強抗性育種材料的篩選和利用具有重大意義.

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Construction of Bivalent Over-Expression Vector of the NPR1 and Defensin Genes and its Transformation into Shatianyou Pummelo (Citrus grandis (L.) Osbeck)

MU Yifan1, ZHONG Guangyan2*, GAO Feng1*, ZHONG Yun2, HU Minlun2, YAN Huaxue2, JIANG Bo2, WU Bo2

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 2. Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China)

To improve the disease resistance of Shatianyou Pummelo (CitrusgrandisL. Osbeck) to Huanglongbing, the open reading frames ofNPR1 andDefensingenes were obtained by PCR from the leaf genomic DNA ofCitrusclementinaand lich cv. “Red March”, respectively, and were cloned into the binary vector pBI 121. The recombinant plasmid harboring both genes of NPR1 and Defensin , named ND-PBI 121, was successfully constructed, and was transformed into Shatianyou Pummelo by theAgrobacteriumtumefaciensmediated transformation. Six transformed plants were obtained. The results provide the basis for study of the function ofNPR1 and Defensin on the resistance of Shatianyou Pummelo to Citrus Huanglongbing.

disease resistance gene; over-expression vector; citrus huanglongbing; genetic transformation;Citrusgrandis(L.) osbeck cv. ‘Shatianyou’

2016-10-27 《華南師范大學學報(自然科學版)》網址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學基金項目(31572113); 廣東省科技計劃項目(2014B020202009，2016B020201006，2014B070706018)

*通訊作者:鐘廣炎，研究員，Email:gy_zhong@163.com；高峰，教授，Email:peak0041@vip.sina.com.

S666.3; Q785

A

1000-5463(2017)06-0060-05

【中文責編：成文；助理編輯：冷佳奕 英文審校：李海航】