梁斯韻， 康 園， 曾麗璇， 張秋云， 羅繼文

(華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣州 510006)

Cd-HA-TiO2聯(lián)合脅迫對小球藻致毒效應(yīng)的研究

梁斯韻， 康 園*， 曾麗璇， 張秋云， 羅繼文

(華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣州 510006)

以小球藻為受試生物，研究Cd-HA-TiO2聯(lián)合暴露體系對小球藻的毒性作用. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cd單獨(dú)作用、Cd-HA和Cd-TiO2聯(lián)合作用下，Cd的96h-EC50分別為:0.166、0.185～0.207和0.185～0.199 mg/L，以上結(jié)果說明當(dāng)HA或TiO2存在情況下，可以降低Cd對小球藻的生物毒性，這主要是由于HA或TiO2可以吸附水中Cd，降低體系中自由金屬離子的質(zhì)量濃度，進(jìn)而減弱了Cd的生物毒性. 但在Cd-HA-TiO2三者聯(lián)合作用下，Cd的96h-EC50降低到0.063～0.089 mg/L，表明當(dāng)HA、TiO2同時(shí)存在時(shí)，Cd對小球藻的生物毒性顯著增強(qiáng). 通過檢測暴露后的丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物(KAT)水平，發(fā)現(xiàn)Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用時(shí)，小球藻的CAT水平顯著高于其他暴露條件(P<0.05)；細(xì)胞內(nèi)Cd分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三者聯(lián)合暴露顯著促進(jìn)了小球藻細(xì)胞內(nèi)的Cd的生物累積量(P<0.05).因此，小球藻的氧化性損傷(CAT水平)和Cd的生物積累水平可能解釋了三者聯(lián)合暴露導(dǎo)致Cd毒性顯著增強(qiáng)的原因.

小球藻； 聯(lián)合毒性； 二氧化鈦； 腐殖酸； 鎘

自20世紀(jì)80年代以來，納米技術(shù)和納米材料發(fā)展迅速，納米二氧化鈦(TiO2)作為基體材料，在食品、化妝品、能源、醫(yī)學(xué)、催化等領(lǐng)域得以廣泛運(yùn)用[1]. 納米二氧化鈦可通過多種途徑進(jìn)入天然水體環(huán)境和生物體內(nèi)，對水生生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn). 水體中的鎘(Cd)主要來源于礦山開采、工業(yè)廢水、土地沖刷等，大氣鎘塵經(jīng)過干濕沉降也可使鎘進(jìn)入環(huán)境水體中[2]. 鎘在天然水體中主要以游離態(tài)存在，也可與水體中的有機(jī)和無機(jī)配體形成可溶性配合物[3]. 腐殖酸(HA)作為一類天然的高分子化合物，在地球中分布廣泛，其含量約占水中總有機(jī)物的50%～90%[4]. 腐殖酸官能團(tuán)中帶有大量羧基、羥基、醌基等活性基團(tuán)，可以與水中多種物質(zhì)發(fā)生物理、化學(xué)作用，改變污染物在水中的遷移和歸宿，進(jìn)而改變污染物質(zhì)對水生生物的生物毒性[5].

藻類作為水生生態(tài)系統(tǒng)初級生產(chǎn)者，是水生生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)組成部分，對水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡、穩(wěn)定和發(fā)展有著十分重要的作用，同時(shí)也是水體污染中的首要受害者. 小球藻由于存在廣泛、生長速度快、易于人工培養(yǎng)、結(jié)構(gòu)簡單、對環(huán)境變化敏感等特點(diǎn)，使其在環(huán)境毒理學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注[6].

已有大量研究考察了單污染物(重金屬、納米二氧化鈦)的生物毒性及其環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)[7-9]. 然而，環(huán)境中還存在多種污染物，多種物質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)合反應(yīng)均會影響某一物質(zhì)的生物有效性和毒性. 也有許多報(bào)道研究了重金屬—腐殖酸、重金屬—二氧化鈦、腐殖酸—二氧化鈦兩者聯(lián)合暴露時(shí)對水生藻類的影響[10-15]，但對3種物質(zhì)聯(lián)合暴露的研究還比較缺乏. 本文旨在將腐殖酸這一自然因素納入考慮范圍中，并選取了Cd和TiO2，研究Cd-HA-TiO2聯(lián)合暴露體系對小球藻的毒性作用，并與單獨(dú)暴露、兩者聯(lián)合暴露作比較，分析Cd-HA-TiO2聯(lián)合暴露下小球藻的生理應(yīng)答.

1 研究方法

1.1 藻類培養(yǎng)

試驗(yàn)所用小球藻由暨南大學(xué)惠贈. 小球藻用水生4號培養(yǎng)基[16]在光照培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)，溫度(25±1) ℃，光照強(qiáng)度6 000 lx，光暗周期16 h∶8 h，每天定時(shí)搖動3次. 小球藻經(jīng)實(shí)驗(yàn)室預(yù)培養(yǎng)使藻細(xì)胞達(dá)到同步化生長，取處于指數(shù)生長期的健康藻細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基所用化學(xué)試劑均為分析純，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化. 腐殖酸為商品腐殖酸，購于上海晶純生化科技股份有限公司. 二氧化鈦類型為P25.

1.2 藻類生物量計(jì)算

通過血球計(jì)數(shù)板對小球藻進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定在水生4號培養(yǎng)基中藻細(xì)胞密度與OD684之間的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：y=3 633.21x，相關(guān)系數(shù)R2=0.997>0.990%，P<0.05，該線性回歸模型擬合優(yōu)度較高，式中，x為小球藻吸光度，y為小球藻細(xì)胞密度(104個(gè)/mL).

1.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)有毒化學(xué)品對藻類毒性測試的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法[17]，取60 mL小球藻液置于100 mL燒杯中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為對照組和實(shí)驗(yàn)組(小球藻起始濃度為:1×104個(gè)/mL). 對照組使用水生4號培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組使用水生4號培養(yǎng)基并加入Cd、HA或TiO2儲備液進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組劃分為以下3組，根據(jù)上述方式進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)分別取樣測定其OD684. 每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行樣.

單因子脅迫實(shí)驗(yàn)：①TiO2單獨(dú)脅迫，TiO2質(zhì)量濃度設(shè)置為:0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L；②HA單獨(dú)脅迫， HA質(zhì)量濃度設(shè)置為:1、5、10 mg/L；③Cd單獨(dú)脅迫， Cd2+的質(zhì)量濃度設(shè)置為:0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.80 mg/L.

兩因子聯(lián)合脅迫實(shí)驗(yàn)：④Cd -TiO2聯(lián)合脅迫；⑤Cd-HA聯(lián)合脅迫；⑥HA -TiO2聯(lián)合脅迫；

三因子聯(lián)合脅迫實(shí)驗(yàn)：⑦Cd-HA-TiO2聯(lián)合脅迫.

根據(jù)單因子脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩因子及三因子聯(lián)合脅迫實(shí)驗(yàn)選取TiO2質(zhì)量濃度為：1、4 mg/L， HA質(zhì)量濃度為：1、5、10 mg/L， Cd2+的質(zhì)量濃度設(shè)置為：0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.80 mg/L.

1.4 小球藻氧化性損傷

小球藻細(xì)胞裂解液制備:培養(yǎng)48、96 h后，取藻液于離心管中，在低溫下以3 500 r/min 離心10 min，棄上清液；用去離子水懸浮藻液，離心，棄上清液；用western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所，P0013)冰浴裂解藻細(xì)胞30 min；低溫下以3 500 r/min 離心10 min，取上清液得到藻細(xì)胞裂解液，用于測定脂質(zhì)氧化(MDA)和過氧化氫酶(CAT).

取上述所得細(xì)胞裂解液，采用脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒(TBA法)(碧云天生物技術(shù)研究所，S0131)，過氧化氫酶檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，S0051)測定脂質(zhì)氧化和過氧化氫酶.

培養(yǎng)48、96 h后，取藻液于離心管中，在低溫下以3 500 r/min 離心10 min，棄上清液；用去離子水懸浮藻液，離心，棄上清液，得藻細(xì)胞備用. 采用超氧化物檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，S0060)測定上述制備所得藻細(xì)胞的超氧化物. 氧化性損傷實(shí)驗(yàn)中根據(jù)1.1步驟對小球藻進(jìn)行培養(yǎng)，其中小球藻起始濃度為:OD684=0.050，ρ(HA)為5 mg/L，ρ(TiO2)為 1 mg/L，ρ(Cd)為0.25 mg/L.

1.5 小球藻對重金屬Cd的積累

用0.45 μm的濾膜對藻液進(jìn)行過濾，濾液加入濃硝酸在120 ℃下消解2 h，用原子吸收分光光度計(jì)測量其Cd質(zhì)量濃度，所得結(jié)果為藻細(xì)胞外Cd部分. 過濾所得藻泥用10 mmol EDTA-Na2重新分散10 min，用0.45 μm的濾膜過濾，濾液加入濃硝酸在120 ℃下消解2 h，原子吸收分光光度計(jì)測量其Cd質(zhì)量濃度，所得結(jié)果為藻細(xì)胞吸附態(tài)Cd. 藻泥加入濃硝酸在120 ℃下消解2 h，用原子吸收分光光度計(jì)測量所得結(jié)果為藻細(xì)胞吸收態(tài)Cd. 其中藻細(xì)胞吸附態(tài)Cd和吸收態(tài)Cd為小球藻積累的Cd部分. 在培養(yǎng)小球藻6、12、24、48、72、96 h時(shí)取樣測定. 吸收實(shí)驗(yàn)中根據(jù)1.1步驟對小球藻進(jìn)行培養(yǎng)，其中小球藻起始濃度為:OD684=0.050，ρ(HA)為5 mg/L，ρ(TiO2)為 1 mg/L，ρ(Cd)為0.25 mg/L.

1.6 數(shù)據(jù)分析及處理

小球藻生長抑制率參照文獻(xiàn)[18]采用相對數(shù)量法進(jìn)行計(jì)算，公式如下:

(1)

式中，I為抑制率(%)，Ntn為實(shí)驗(yàn)組n時(shí)刻測定時(shí)藻生物量；Nt0為實(shí)驗(yàn)組初次測定時(shí)藻生物量，NCn為對照組n時(shí)刻測定時(shí)藻生物量；NC0為對照組初次測定時(shí)藻生物量.

細(xì)胞吸收模型參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行計(jì)算，公式如下:

式中，Ci為藻細(xì)胞積累的Cd(mg/1010個(gè)藻細(xì)胞)；Ce為藻細(xì)胞外的Cd(mg/1010個(gè)藻細(xì)胞)；K0為藻細(xì)胞積累Cd的速率；K1為藻細(xì)胞清除Cd的速率；t為暴露時(shí)間.

利用軟件SPSS 16.0求出線性回歸方程并計(jì)算不同暴露情況下Cd的96h-EC50；并利用單因素分析(ANVOA)、多重比較檢驗(yàn)法(LSD法和Tamhane’s T2法)進(jìn)行組間差異性檢驗(yàn). 結(jié)果中*P<0.05表示存在顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 Cd、HA、TiO2對小球藻的毒性作用

2.1.1 Cd、HA、TiO2單獨(dú)脅迫對小球藻的毒性作用 HA單獨(dú)作用下，小球藻的生長曲線與對照組相比沒有顯著性差異(圖1A)，表明在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)HA單獨(dú)作用時(shí)不會對小球藻產(chǎn)生生長抑制作用. 與HA類似，TiO2單獨(dú)作用下(圖1B)，小球藻的生長與對照組基本一致，無顯著性差異，研究[20]表明TiO2的生物毒性與其顆粒形狀、粒徑大小和化學(xué)組成等因素有關(guān)，藻類對TiO2的耐受性也具有種屬特異性. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該質(zhì)量濃度下TiO2不會抑制小球藻的生長.

對照組與Cd實(shí)驗(yàn)組的小球藻生物量均隨著暴露時(shí)間的延長逐漸升高(圖1C). 在Cd脅迫下，實(shí)驗(yàn)組每個(gè)時(shí)間段的藻生物量均低于對照組，小球藻生長受到明顯的抑制作用. 且隨著Cd質(zhì)量濃度的增加，藻生物量逐漸降低，表明該生長抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為0.05、0.10 mg/L時(shí)，小球藻96 h的生長抑制率分別為8.57%和19.09%，當(dāng)Cd質(zhì)量濃度提高至0.40、0.80 mg/L時(shí)，小球藻96 h的生長抑制率分別上升93.27%和96.30%. Cd對小球藻的生長抑制作用可能與破壞小球藻新陳代謝、干擾葉綠素合成和影響光合作用有關(guān). Cd可以與細(xì)胞膜上的巰基結(jié)合，阻止Ca的跨膜運(yùn)輸從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca減少，Ca的減少可能導(dǎo)致藻細(xì)胞內(nèi)部代謝紊亂[21]. 同時(shí)，Cd可以抑制原葉綠素酸酯及其底物的合成，進(jìn)而影響葉綠素的合成[20]. Cd還可以通過損害藻細(xì)胞的PSⅡ中心和阻礙光合電子傳遞過程進(jìn)而影響藻細(xì)胞的光合作用[7]

圖1 HA、TiO2和Cd對小球藻生物量的影響

2.1.2 Cd、HA、TiO2兩因子聯(lián)合脅迫對小球藻的毒性作用 與Cd單獨(dú)作用相似(圖2A)，在2種聯(lián)合作用下，隨著Cd質(zhì)量濃度增加，小球藻96 h的生長抑制率均增加. Cd單獨(dú)作用時(shí)，Cd的96 h-EC50為0.166 mg/L；Cd-HA聯(lián)合作用時(shí)(HA質(zhì)量濃度為1、5、10 mg/L)，Cd的96 h-EC50分別為：0.185、0.185、0.207 mg/L； Cd-TiO2聯(lián)合作用時(shí)(圖2B,TiO2質(zhì)量濃度為1、4 mg/L)，Cd的96 h-EC50分別為0.185、0.199 mg/L. 與Cd單獨(dú)作用相比，當(dāng)體系中存在HA或TiO2時(shí)，Cd的96 h-EC50均有不同程度的提升，表明HA或TiO2存在情況下，可以降低Cd對小球藻的生長抑制作用(P>0.05). 根據(jù)自由離子活度模型(FIAM)，金屬離子對藻類毒性與體系中自由金屬離子的濃度呈正相關(guān)[22]. HA上帶有大量羧基、羥基等活性基團(tuán)，使得腐殖酸表面帶有較大的負(fù)電性[5]. 因此HA可以與水中的Cd離子發(fā)生離子交換、螯合、絮凝、表面吸附等作用，降低水體中Cd自由離子的濃度，從而降低Cd的吸收和毒性. 已有研究[13]表明TiO2顆粒可以吸附Cd，減少其外界環(huán)境中游離Cd的濃度，進(jìn)而降低Cd對小球藻的生長抑制作用.

由圖2C可知，當(dāng)HA-TiO2聯(lián)合作用時(shí)，小球藻96 h生長抑制率與TiO2單獨(dú)作用(HA為0 mg/L)相比均有不同程度的上升. 當(dāng)HA質(zhì)量濃度一定時(shí)，小球藻的生長抑制作用隨著TiO2質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，對TiO2質(zhì)量濃度呈現(xiàn)明顯的依賴關(guān)系. 當(dāng)HA為5.0 mg/L， TiO2質(zhì)量濃度為0.5、1.0 mg/L時(shí)，小球藻96 h生長抑制率分別為2.83%和7.40%. 當(dāng)TiO2質(zhì)量濃度為8.0 mg/L時(shí)，生長抑制率上升至64.53%. 這主要是由于TiO2具有光敏活性，在光照情況下能對HA進(jìn)行光解作用產(chǎn)生活性氧(ROS)，ROS基團(tuán)具有強(qiáng)氧化性會對小球藻產(chǎn)生脅迫作用，導(dǎo)致小球藻在HA-TiO2聯(lián)合作用時(shí)生長抑制率上升[10].

2.1.3 Cd、HA和TiO2三因子聯(lián)合脅迫對小球藻的毒性作用 在Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用下(圖3)，當(dāng)Cd質(zhì)量濃度<0.40 mg/L時(shí)，各組小球藻的96 h生長抑制率遠(yuǎn)高于Cd單獨(dú)作用時(shí)，與其存在顯著性差異(P<0.05). 由表1可知，小球藻在Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用下，Cd的96 h-EC50為0.063～0.089 mg/L，遠(yuǎn)低于Cd單獨(dú)作用、Cd-HA和Cd-TiO2聯(lián)合作用這3種情況的96 h-EC50. 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)HA和TiO2同時(shí)存在時(shí)，Cd對小球藻的生長抑制作用明顯增強(qiáng). 且當(dāng)TiO2質(zhì)量濃度由1.0 mg/L上升至為4.0 mg/L時(shí)， Cd-HA-TiO2聯(lián)合脅迫對小球藻生長抑制作用顯著增強(qiáng). 當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為0.05 mg/L，TiO2質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，小球藻的96 h生長抑制率為34.83%～54.30%，當(dāng)TiO2質(zhì)量濃度上升至4.0 mg/L時(shí)，小球藻的96 h生長抑制率上升到66.55%～84.25%，存在組間差異.

圖2 Cd-HA、Cd-TiO2和HA-TiO2聯(lián)合作用下對小球藻生長作用的影響

Figure 2 Effects of Cadmium on the growth ofChlorellain the exposure of Cd-HA、Cd-TiO2and HA-TiO2for 96 h

圖3 Cd- HA-TiO2聯(lián)合作用下對小球藻生長作用的影響

Figure 3 Effects of Cadmium on the growth ofChlorellain the exposure of Cd-HA-TiO2for 96 h

表1 小球藻在不同暴露條件下的回歸方程及96 h-EC50Table 1 Regression equations and 96 h-EC50 of Chlorella growth under different exposure conditions

當(dāng)Cd質(zhì)量濃度大于0.40 mg/L，藻的生物量均急劇下降，不同暴露條件下的96 h生長抑制率相近，不存在顯著性差異(P>0.05)，這主要是由于高質(zhì)量濃度的Cd就可以引起較強(qiáng)的生長抑制作用和毒性效應(yīng)，其他因素的影響相對較弱. 因此，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注當(dāng)Cd質(zhì)量濃度相對較低以及HA和TiO2同時(shí)存在時(shí)，Cd對小球藻的毒性作用增加的原因及機(jī)制.

2.2 不同暴露情況下小球藻的氧化性損傷

丙二醛(MDA)是生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物. 動物或植物細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，會發(fā)生脂質(zhì)氧化，一些脂肪酸氧化后逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物，其中包括MDA. 因此可通過監(jiān)測MDA的水平檢測脂質(zhì)氧化的水平. 不同暴露條件下的小球藻的脂質(zhì)氧化水平如圖4A所示，在Cd脅迫48、96 h后，小球藻的MDA與對照組相比明顯上升，表明有自由基產(chǎn)生與造成損傷的過程. 且96 h時(shí)小球藻在不同暴露條件下的MDA均高于48 h(對照組除外)，表明小球藻的脂質(zhì)氧化損傷隨著脅迫時(shí)間增長而增強(qiáng). 外界脅迫96 h后，Cd單獨(dú)作用、Cd-HA和Cd-TiO2聯(lián)合作用這3種情況下，MDA分別為對照組的1.69倍、2.11倍、1.84倍；在Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用時(shí)，MDA為對照組2.06倍. 脂質(zhì)氧化可以破壞細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞代謝[23].

植物體內(nèi)的過氧化氫酶(CAT)可以把機(jī)體代謝產(chǎn)生的H2O2分解為H2O和O2，具有解毒作用[24]. 外界脅迫下，細(xì)胞體內(nèi)代謝產(chǎn)生的H2O2增加，會誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的過氧化氫酶，因此CAT也可作為氧化性損傷標(biāo)志. 由圖4B可知，在沒有Cd脅迫的情況下，小球藻的CAT活力與對照組相近. 在Cd脅迫48、96 h后，小球藻的CAT與對照組相比均有明顯上升. 在Cd單獨(dú)作用、Cd-HA和Cd-TiO2聯(lián)合作用這3種情況下，當(dāng)外界脅迫48 h后， CAT分別為1.11、1.44和1.26 U/109個(gè)藻細(xì)胞，其中在Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用時(shí)，CAT水平達(dá)到1.83 U/109個(gè)藻細(xì)胞，為對照組的2.61倍. Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用96 h后，相比其他暴露條件，CAT依然最高，達(dá)到1.85 U/109個(gè)藻細(xì)胞，為對照組的2.48倍 (P<0.05). 這可能是因?yàn)榕c其他暴露條件相比，Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用時(shí)小球藻代謝產(chǎn)生的H2O2水平較高，從而誘導(dǎo)了較多的過氧化氫酶產(chǎn)生.

超氧化物(KAT)通常指超氧化物陰離子，是一種氧分子自由基.在呼吸鏈中，NADPH氧化酶把電子傳遞給氧分子時(shí)會產(chǎn)生超氧化物陰離子，它可以導(dǎo)致氧化性損傷. 由圖4C可以看出，在不同環(huán)境暴露48和96 h后，小球藻產(chǎn)生的KAT水平相近，不存在顯著性差異(P>0.05). 這可能是因?yàn)椴煌拿{迫環(huán)境不會對藻細(xì)胞的NADPH氧化酶產(chǎn)生明顯影響.

圖4 在不同條件下暴露48 h和96 h后小球藻的MDA、CAT 和KAT含量

Figure 4 MDA, CAT and KAT ofChlorellaafter 48 h and 96 h in different exposure conditions

2.3 不同暴露情況下小球藻對Cd的積累

外界環(huán)境存在Cd時(shí)，小球藻會吸收外界環(huán)境的Cd. 當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間<12h，藻細(xì)胞對Cd的積累主要是吸附在細(xì)胞壁上(圖5)，當(dāng)吸附達(dá)到平衡時(shí)藻細(xì)胞不再積累Cd，單位數(shù)量小球藻的Cd積累基本維持在同等水平. 隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，吸附在細(xì)胞壁上的Cd逐漸轉(zhuǎn)移進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)部，單位數(shù)量小球藻的Cd積累略有上升. 當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間>24小時(shí)，小球藻分裂繁殖，其生物量增加. 在體系中Cd總量一定的情況下，單位數(shù)量小球藻的Cd積累逐漸下降.

暴露 24、48、72和96 h時(shí)后(圖5)，小球藻在Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用下對Cd的生物積累均高于其他3種情況(P<0.05). 由表2可知，HA和TiO2同時(shí)存在情況下，Cd在小球藻細(xì)胞內(nèi)外的累積系數(shù)(細(xì)胞積累Cd的速率/細(xì)胞代謝Cd的速率)也均高于其他3種情況. 以上結(jié)果表明Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用下，小球藻對Cd的吸收和積累相對其他暴露條件有所增加. 這可能是由于HA和TiO2黏附在藻細(xì)胞表面，而TiO2在光照條件下可以光解HA產(chǎn)生ROS基團(tuán)，可能改變細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，使得藻細(xì)胞對體系中游離Cd的積累增加.

此外，Cd在三者聯(lián)合作用下的藻細(xì)胞累積量增加可能與細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)有關(guān)系. 有研究表明，Cd進(jìn)入硅藻細(xì)胞主要通過ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[25]. 三者聯(lián)合暴露是否會影響小球藻的ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，同時(shí)需要小球藻內(nèi)ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因注釋工作的推動. 而Cd-HA- TiO2三者聯(lián)合作用，是否會改變Cd的形態(tài)從而改變Cd的毒性，比如形成有機(jī)鎘，也需要進(jìn)一步的工作進(jìn)行研究.

圖5 96 h內(nèi)Cd單獨(dú)作用、Cd-HA、Cd-TiO2和Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用下對單位數(shù)量小球藻生物積累Cd的影響

Figure 5 Cd bioaccumulation inChlorellain the exposure of Cd, Cd-HA, Cd-TiO2or Cd-HA-TiO2

表2不同暴露條件下Cd在小球藻細(xì)胞的累積

Table 2 Ratios of Cd bioaccumulation inside and outside theChlorellacells

暴露條件CdCd-HACd-TiO2Cd-HA-TiO2累積系數(shù)1．331．091．131．63

注：累積系數(shù)=細(xì)胞積累Cd的速率/細(xì)胞代謝Cd的速率

3 結(jié)論

以小球藻為受試生物，研究了Cd-HA-TiO2聯(lián)合暴露體系對小球藻的毒性作用以及小球藻的生理應(yīng)答. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:

(1)在Cd脅迫下，小球藻的生長受到抑制，且呈劑量依賴效應(yīng).當(dāng)HA或TiO2存在時(shí)，HA或TiO2可以吸附水中Cd，降低體系中自由金屬離子的質(zhì)量濃度，從而降低Cd對小球藻的生物毒性. 當(dāng)HA、TiO2同時(shí)存在時(shí)，Cd對小球藻的生物毒性顯著增強(qiáng).

(2)在Cd脅迫下，小球藻的MDA、CAT水平均明顯高于對照組，表明有自由基產(chǎn)生與造成氧化損傷. 在Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用時(shí)，小球藻的CAT水平最高.

(3)在Cd-HA-TiO2聯(lián)合作用時(shí)，藻細(xì)胞對Cd的生物積累高于其他暴露條件下Cd的生物積累.

(4)結(jié)合急性毒性結(jié)果，HA、TiO2同時(shí)存在時(shí)，Cd對小球藻的生物毒性顯著增強(qiáng)可能與藻細(xì)胞的氧化性損傷和Cd的生物積累增加有關(guān).

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Combined Toxicological Effects of Cadmium, Humic Acid and TiO2on Chlorella

LIANG Siyun, KANG Yuan*, ZENG Lixuan, ZHANG Qiuyun, LUO Jiwen

(School of Chemistry and Environment, South China Normal University, Guangzhou 510006, China)

Chlorellawas selected to test the combined toxicological effects of cadmium (Cd), humic acid (HA) and TiO2. The results showed that the 96h-EC50of Cd, Cd-HA and Cd-TiO2was 0.166, 0.185～0.207 and 0.185～0.199 mg/L, respectively, indicating that the toxicity of cadmium was attenuated in the presence of HA or TiO2. This was mainly due to the reduction of free Cd ion through combination of HA and TiO2. However, the 96h-EC50of Cd-HA-TiO2was decreased to 0.063～0.089 mg/L, indicating that the toxicity of cadmium was significantly increased in the presence of HA and TiO2.Chlorellashowed the highest CAT level after exposure to Cd-HA-TiO2compared to other treatments. In addition，the bio-accumulation level of Cd was the highest after exposure to Cd-HA-TiO2. This may explain the highest toxicity observed in the Cd-HA-TiO2exposure group.

Chlorella; combined effect; titanium dioxide; humic acid; cadmium

2016-10-25 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41301563)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020216036)

*通訊作者:康園，副教授，Email:kangyuan@m.scnu.edu.cn.

X171.5

A

1000-5463(2017)06-0052-08

【中文責(zé)編：成文 英文審校：李海航】