李雨欣，王秀英，張國慶

(1.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 ?？?570228; 2.海南省水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，海南 海口 570126)

基于mtDNA控制區(qū)的波紋唇魚的4個不同地理群體的遺傳多樣性

李雨欣1，王秀英2，張國慶1

(1.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 海口 570228; 2.海南省水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，海南 海口 570126)

以海南陵水、西沙、南沙以及馬來西亞4個地理區(qū)域的101尾波紋唇魚作為研究對象，利用mtDNA控制區(qū)序列對波紋唇魚進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并通過擴(kuò)增、克隆與序列測定技術(shù)，獲得了mtDNA控制區(qū)905 bp的序列，其多態(tài)性遺傳參數(shù)的統(tǒng)計(jì)顯示，在101尾個體中存在110個變異位點(diǎn)和71個單倍型；總?cè)后w的單倍型多樣性(Hd)為0. 981，核苷酸的多樣性指數(shù)(Pi)為0.005 79，表明其遺傳多樣性處于較低水平.Tajima’s D中性檢測均為負(fù)值，F(xiàn)st值屬于較低水平，僅為0.031 95，分子方差分析(AMOVA)和Kimuar 2參數(shù)模型的分析表明，這4個不同地理群體的波紋唇魚是由一個小而高效的種群迅速發(fā)展而來的，且其遺傳多樣性和遺傳分化水平較低.

波紋唇魚; mtDNA控制區(qū); 遺傳多樣性;遺傳分化

波紋唇魚(Cheilinusundulatus)俗稱蘇眉魚，屬鱸形目(Pereifomes)，隆頭魚科(Labridae)，唇魚屬(Cheilinus)[1],主要分布于我國東海南部及南海海域；在世界范圍主要分布于太平洋西部熱帶海域、印度洋西北部、大堡礁及紅海[2].波紋唇魚的幼魚常生活在珊瑚礁礁盤的內(nèi)側(cè)淺水區(qū)，其成魚則多生活于珊瑚礁礁盤的外側(cè)深水水域[3].波紋唇魚的肉質(zhì)富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和多種微量元素，其肉味鮮美，因而導(dǎo)致了人們對其的過度捕撈[4].近年來，國際動物保護(hù)組織已將波紋唇魚列入瀕危物種的名錄中(IUCN，CITES等)[5].因此，開展波紋唇魚種質(zhì)資源的調(diào)查可為該物種的保護(hù)提供有價值的參考資料.

線粒體DNA(mtDNA)可作為魚類遺傳分化的一種標(biāo)記，它是研究因地理隔離而產(chǎn)生遺傳差異的主要標(biāo)識之一[6].底棲魚類的活動范圍有限，其生活的水系亦存在差異，因而造成其群體間存在明顯的地理隔離及分化，究其原因是因?yàn)閙tDNA單倍型發(fā)生變異；因此，探究魚類不同地理群體的mtDNA，這是探索魚類群體遺傳多樣性和獲知其相關(guān)遺傳生物學(xué)信息的有效途徑.傳統(tǒng)的魚類種群識別是基于形態(tài)、細(xì)胞、同工酶等標(biāo)記，但重要遺傳變異的分子機(jī)制是傳統(tǒng)手段無法揭示的，而大量存在于mtDNA控制區(qū)的分子標(biāo)記卻可作為區(qū)分種群的有力標(biāo)識.mtDNA的存活時間較長，而且遺傳自母親，因此以其來確認(rèn)家庭關(guān)系十分理想[7]，且以它作為一種分子遺傳標(biāo)記，其檢測十分簡便[8].通過mtDNA控制區(qū)部分序列和微衛(wèi)星的分析，Beheregaray揭示了在來自于海洋和江河口的銀漢魚群中所存在的明顯的遺傳分化[9]；Grunwald等亦分析了短鼻鱘群體mtDNA控制區(qū)的部分序列，揭示了該群體的地理遺傳差異[10].因此，通過分析mtDNA控制區(qū)的全部或部分序列，可獲得種群間的親緣關(guān)系、起源、分化以及遺傳距離等重要的遺傳分化信息.

為了獲得群體分化與遺傳結(jié)構(gòu)的綜合評價，本研究通過分子標(biāo)記的手段，對南海4個不同地理區(qū)域的波紋唇魚的mtDNA控制區(qū)進(jìn)行了評估(陵水、西沙、南沙以及馬來西亞),旨在分析該區(qū)域波紋唇魚的序列變異和序列多態(tài)性，探討該物種種質(zhì)資源的分布狀況，以便為該物種的保護(hù)和遺傳育種奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1樣品采集如圖1所示，實(shí)驗(yàn)樣品來自南海海域的4個野生群體，海南陵水(LC)有31尾，西沙(XC)有14尾,南沙(NC)有36尾，馬來西亞(MC)有20尾，共計(jì)101尾波紋唇魚.實(shí)驗(yàn)是通過采集魚體的尾鰭組織來提取DNA的.

圖1 波紋唇魚群體采集分布注：陵水(●), 西沙 (▲), 南沙(■), 馬來西亞 (★)

1.2DNA的提取、擴(kuò)增、克隆及測序分別取0.1 g尾鰭組織來提取基因組DNA，提取采用的是“酚-氯仿”法，并在50 μL的TE中溶解，于-20 ℃保存(備用).通過PCR擴(kuò)增可獲取mtDNA控制區(qū)域，PCR 反應(yīng)總體積均為25 μL，其中包括2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL Mg2+(25 mmol/L)，2 μL dNTP(2 mmol/L)，正反向引物各1 μL(10 μmol/L，見表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，0.3 μL Taq DNA polymerase (5 U/μL)，14.2 μL ddH2O，模板2 μL.PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；熱循環(huán)94 ℃、30 s，54 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min；共30 cycle，最后72 ℃延伸10 min.

擴(kuò)增所得的產(chǎn)物一部分送上海華大基因公司進(jìn)行測序鑒定，另一部分則與載體(pMDTM18-T Vector)連接，并導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞(DH5ɑ).接著，挑取目的菌落并將其轉(zhuǎn)入含有特定抗生素(氨芐)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增，然后測序和鑒定.

表1 引物序列

1.3數(shù)據(jù)處理將兩種測序結(jié)果與波紋唇魚mtDNA序列(accession number: GU296101)進(jìn)行比對(blast)，以確認(rèn)mtDNA控制區(qū)域，然后運(yùn)用軟件(MEGA5.0)來構(gòu)建所得序列的NJ系統(tǒng)樹，各分支的置信度由1 000次Bootstrap法來檢驗(yàn)[11]，并計(jì)算群體內(nèi)/間的平均遺傳距離；遺傳多樣性參數(shù)，如核苷酸多樣性Pi以及單倍型多樣性Hd等則是通過運(yùn)用Dnasp 5.0軟件[12]來計(jì)算得出；遺傳分化參數(shù)，如4個群體的單倍型數(shù)目、類型及分布、堿基含量等則是由Areliquin 3.11軟件[13]計(jì)算得出，并經(jīng)AMOVA分析和Tajima’s D值中性檢驗(yàn).

2 結(jié) 果

2.1序列多態(tài)性對4個群體(共101尾波紋唇魚個體)的mtDNA控制區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和測序后，獲得了905 bp的序列，揭示出110個突變位點(diǎn)(見表2).在這些多態(tài)性位點(diǎn)中的堿基被取代最多，僅少部分為缺失和插入.在LC，MC，XC和NC群體中分別存在63，35，14和53個突變位點(diǎn)，總?cè)后w中4個堿基的平均含量分別為24.42%(T), 28.47%(C), 27.88%(A)和19.23%(G)(見表3).

表2 波紋唇魚群體mtDNA控制區(qū)的遺傳多樣性參數(shù)

表3 波紋唇魚群體mtDNA控制區(qū)的堿基含量

2.2單倍型和遺傳群體分析基于堿基突變，101條序列被劃分為71個單倍型，4個群體的單倍型數(shù)量分別是29，17，9，29(見表4)，每一個群體都擁有其特異的單倍型，NJ進(jìn)化樹顯示(見圖2)，這4個群體的71個單倍型分成了2個較為明顯的分支，基于上述單倍型之間的分析，結(jié)果表明：群體的遺傳差異并不顯著.由于許多分支的BP(bootstrap proportion)值小于50%，所以該進(jìn)化樹中幾乎沒有相似的單倍型.該種群的總核苷酸多樣性值較低，僅為0.005 79，但其單倍體多樣性卻很高，達(dá)到了0.981,且所有種群的Tajima’s D值均為負(fù)值(XC,P> 0.05；P< 0.05).基于Kimuar 2參數(shù)模型，因地理差異而導(dǎo)致的2個種群間的遺傳距離從0.005 02到0.006 70不等，種群內(nèi)部的遺傳距離分布在0.005 25～0.006 98的范圍(見表5).總體上，LC，MC，XC以及NC種群內(nèi)部的平均遺傳距離分別為0.006 13，0.005 46，0.006 70和0.005 02，然而，一些種群內(nèi)部的遺傳距離甚至大于種間的遺傳距離，LC與MC、LC與XC、LC與NC的遺傳距離分別為0.005 87，0.006 98和0.005 55；MC與XC和MC與NC的遺傳距離分別為0.006 58和0.005 25，XC與NC的遺傳距離為0.006 57.

2.3群體結(jié)構(gòu)Fst分析結(jié)果顯示，HC與XC之間、HC與NC之間的Fst值均大于0.15，但所有種群間的差異并不顯著 (P> 0.05).當(dāng)運(yùn)用AMOVA方法對波紋唇魚群體的方差分量進(jìn)行解析時，結(jié)果顯示，種間發(fā)生的分子變異比例達(dá)到了96.81%，種群內(nèi)的變異僅為3.19%的(見表6).

表4 波紋唇魚4個群體的單倍型

表5 群體間/內(nèi)遺傳距離及分化

“*”為群體內(nèi)的Kimura 2-parameter 遺傳距離.

表6 波紋唇魚四個群體mtDNA控制區(qū)的AMOVA分析

3 討 論

波紋唇魚mtDNA控制區(qū)的單倍型多樣性較高(0.981)，但核苷酸多樣性屬于一個中等偏低的水平[14](0.005 79)，此結(jié)果與對短鼻鱘魚mtDNA控制區(qū)序列的單倍型和核苷酸多樣性的分析很相似[10].不同的是，波紋唇魚的單倍體和核苷酸多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大馬哈魚的(Hd:0.63,Pi:0.003 7)單倍體和核苷酸多樣性[15]，這或許是序列長度的差異所造成.波紋唇魚的mtDNA控制區(qū)(905 bp)與大馬哈魚[15]的mtDNA控制區(qū)(500 bp)和短鼻鱘[16]的mtDNA控制區(qū)(440 bp)相比較，其可能能揭示出更多的變異位點(diǎn)；然而，與短鼻鱘魚和大馬哈魚的大種群相比，波紋唇魚是一種瀕危物種，其種群數(shù)量有限，這可能會限制單倍型多樣性和核苷酸多樣性的評估分析.

圖2 波紋唇魚mtDNA控制區(qū)單倍型NJ進(jìn)化樹

波紋唇魚4個群體的Fst值水平較低(0.031 95)，這表明其群體間的遺傳分化較低[17]，此外，總?cè)后w中的Tajima's D值均為負(fù)值，這可能是種群擴(kuò)增現(xiàn)象的有力依據(jù)，同時，它在某種程度上解釋了高單倍型但低核苷酸多樣性的群體分化現(xiàn)象.結(jié)果表明，海南陵水、西沙、南沙以及馬來西亞的波紋唇魚群體是由一個“精”而高效的群體迅速發(fā)展而來，因此，它無法在倉促時間內(nèi)積淀較為重要的核苷酸變異[19]；所以其種群和個體間的遺傳距離幾乎處于同一水平，前者比后者稍低一些.AMOVA的分析結(jié)果表明，該物種4個群體的遺傳分化較低，但基因交換率卻較高.

基于波紋唇魚mtDNA控制區(qū)的分析結(jié)果表明，這4個不同地理區(qū)域的波紋唇魚的群體遺傳多樣性和遺傳分化程度較低，這或許是因?yàn)槿后w有限而導(dǎo)致近交頻率升高的緣故，進(jìn)而導(dǎo)致了遺傳多樣性降低.波紋唇魚分布的地域較窄，且還伴隨著捕撈量劇增，這使得基因之間的交換頻率降低，從而造成遺傳多樣性降低.所以，加強(qiáng)針對該物種的研究和保護(hù)是非常有必要的，可見，我們的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析對這一物種的人工繁殖和保護(hù)是有用的.

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GeneticDiversityandDivergenceofCheilinusundulatesfromFourDifferentGeographicPopulationsBasedonmtDNAControlRegion

Li Yuxin1, Wang Xiuying2, Zhang Guoqing1

(1. The Ocean College, Hainan University, Haikou 570228, China;2. Testing Center for Aquatic Product Quality and Safety in Hainan Province, Haikou 570126, China)

In the report, based on the analysis of mtDNA control region, the genetic diversity and divergence of 101Cheilinusundulatesfrom Lingshui, Malaysia, Xisha, and Nansha were analyzed. The 905 bp fragment of the mtDNA control region was obtained by amplification and cloning. There were 110 variation sites, 71 haplotypes in 101 individuals, the total population haplotype diversity (Hd) was 0.981, and the nucleotide diversity index (Pi) was 0.005 79, which indicated that the genetic diversity was low. The data of Tajimas’ D test was negative, and Fst was only 0.031 95. The results of AMOVA and Kimuar 2 parameter model analysis suggested that the different geographical populations ofC.undulatusare developed from a small and efficient population, and the genetic diversity and divergence of four geographical populations ofC.undulatuswere low.

Cheilinusundulatus; mtDNA control region; genetic diversity; genetic divergence

2017-09-25

國家自然科學(xué)基金(40966003)；海南省自然科學(xué)基金(809009)

李雨欣(1991-)，女，海南海口人，海南大學(xué)海洋學(xué)院2013級碩士研究生，E-mail： wenxinfish@163.com

張國慶(1986-)，男，黑龍江安達(dá)人，博士，工程師，E-mail: zhangguoqing27@163.com

1004-1729(2017)04-0359-07

S917.4

ADOl10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0055