羅文杰，鐘亨任，何露露，邵佳琪，宋彥廷，張英霞

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?570228)

抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌穩(wěn)定性及其抗菌機(jī)理

羅文杰，鐘亨任，何露露，邵佳琪，宋彥廷，張英霞

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?570228)

Lc-NKlysin-1是從海洋魚(yú)類(lèi)——大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)中獲得的抗菌肽，為進(jìn)一步優(yōu)化該抗菌肽和研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，本文截取了其N(xiāo)末端的12個(gè)氨基酸殘基，設(shè)計(jì)并合成了抗菌肽Lc-NKlysin-1a，同時(shí)，通過(guò)瓊脂板打孔法，對(duì)其抗菌活性，不同溫度、pH值、鹽濃度等對(duì)其抗菌活性的影響，其溶血活性，最低抑菌質(zhì)量濃度，其抗菌特征等進(jìn)行了研究，并在掃描電鏡下觀察了其對(duì)細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響.結(jié)果表明：抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、抗鏈霉素大腸桿菌)均具有抗菌活性；但對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和抗鏈霉素大腸桿菌的抗菌活性最好，其最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)在15.625～31.25 μg·mL-1之間；相對(duì)于Lc-NKlysin-1，Lc-NKlysin-1a的抗菌活性明顯增強(qiáng)；Lc-NKlysin-1a在15.625～31.25 μg·mL-1時(shí)，其溶血率為3.80%～7.37%，溶血活性較低；Lc-NKlysin-1a對(duì)溫度、pH和鹽等具有良好的耐受性，且穩(wěn)定性高.此外，通過(guò)掃描電鏡還觀察到，抗菌肽Lc-NKlysin-1a作用于細(xì)菌后細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，其細(xì)胞膜出現(xiàn)了褶皺和塌陷的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致了內(nèi)溶物外瀉而死亡.改造后的抗菌肽其相對(duì)分子質(zhì)量小，活性高，穩(wěn)定性強(qiáng)，更易于被開(kāi)發(fā)成抗菌肽類(lèi)藥物.

抗菌肽； 大黃魚(yú)； 抗菌活性； 穩(wěn)定性； 機(jī)理

抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用是人類(lèi)醫(yī)學(xué)史上的巨大進(jìn)步，它挽救了數(shù)以?xún)|計(jì)的生命[1]，但抗生素的濫用亦導(dǎo)致了許多耐藥菌出現(xiàn)，這些耐藥菌給人類(lèi)的健康帶來(lái)了極大的威脅.抗菌肽是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類(lèi)抵抗外界病原體感染的肽類(lèi)生物活性物質(zhì)，它廣泛存在于昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物及人體內(nèi)[2].抗菌肽不僅具有抗生素的抗菌特性，而且與傳統(tǒng)的抗生素相比，它還具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、使用后無(wú)藥物殘留和具有熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，因此，它可作為一種新型的抗生素替代品[3-4].海洋擁有豐富的生物多樣性和生態(tài)環(huán)境多樣性，其中，無(wú)脊椎動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)是海洋生物多樣性的代表，是具有新型結(jié)構(gòu)和功能的抗菌肽的重要來(lái)源.大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)是一種海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，為我國(guó)傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”之一[5]，Zhou等從大黃魚(yú)中獲得了多種抗菌肽，他對(duì)抗菌肽Lc-NKlysin-1(GLLKSLCKKFVKGHLGELIEELTTSDD)的抗菌活性進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)Lc-NKlysin-1對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有抗菌活性，而對(duì)副溶血弧菌不具有活性[6].抗菌肽的正電荷數(shù)、疏水性、兩親性α-螺旋、肽鏈長(zhǎng)度、C-末端或N-末端二級(jí)結(jié)構(gòu)等都與其抗菌活性或溶血活性密切相關(guān)，因此，通過(guò)刪除或替換抗菌肽中的氨基酸，可以獲得活性更好的抗菌肽[7～8].為了優(yōu)化抗菌肽Lc-NKlysin-1，通過(guò)對(duì)其結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Lc-NKlysin-1含有27個(gè)氨基酸殘基，其合成成本相對(duì)較高，且抗菌肽Lc-NKlysin-1帶有1 個(gè)負(fù)電荷，不利于與帶有負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁相互作用.為此，本研究截取了其N(xiāo)-末端的12個(gè)氨基酸殘基序列，并進(jìn)行了固相合成，同時(shí)將其命名為L(zhǎng)c-NKlysin-1a(GLLKSLCKKFVK).抗菌肽Lc-NKlysin-1a(電荷數(shù)+4)富含賴(lài)氨酸，相對(duì)于原模版抗菌肽Lc-NKlysin-1(電荷數(shù)-1)，其所帶正電荷增加，堿性帶有正電荷的區(qū)域與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁可相互作用，從而使抗菌肽更易于吸附到細(xì)胞壁上.Lc-NKlysin-1a中的亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸構(gòu)成了疏水性區(qū)域，這有利于抗菌肽通過(guò)細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層.Lc-NKlysin-1a中還含有甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和賴(lài)氨酸，這些極性氨基酸形成的區(qū)域和疏水性氨基酸形成的區(qū)域形成了兩親性的分子結(jié)構(gòu)，這是抗菌肽發(fā)揮抗菌作用的基礎(chǔ)[9].Lc-NKlysin-1a與模版抗菌肽相比，其疏水性氨基酸的含量相對(duì)減少，這有利于降低其溶血活性.鑒此，筆者研究了抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌活性和其在不同條件下的抗菌穩(wěn)定性，旨在獲得一種抗菌活性穩(wěn)定，溶血率低，合成成本低，且相較于原抗菌肽活性更好的抗菌肽；并試圖在此基礎(chǔ)上，通過(guò)殺菌曲線(xiàn)和掃描電鏡來(lái)初步探究抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌機(jī)理.

1 材料與方法

1.1菌株受試菌株，革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)、抗鏈霉素大腸桿菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，ATCC 15442)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus，實(shí)驗(yàn)室分離)；革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 25923)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，ATCC 6633).

1.2抗菌肽Lc-NKlysin-1a的合成通過(guò)固相合成法來(lái)合成多肽(上海吉爾生化)，并利用RP-HPLC進(jìn)行純化(純度大于95%)，然后凍干，用MALDI-TOF檢測(cè)合成的多肽.

1.3抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌活性檢測(cè)以瓊脂板擴(kuò)散法測(cè)定抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌活性[10].分別將所測(cè)試的6株細(xì)菌的單菌落接種于5 mL的 LB液體培養(yǎng)基中，并于37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，接著調(diào)整菌液濃度至1.2×109CFU·mL-1，取200 μL菌懸液，將其加至50～55 ℃的100 mL的LB培養(yǎng)基中，搖勻，倒入培養(yǎng)皿，冷卻，打孔.于孔中分別加入8 μL2 g·L-1的卡那霉素(陽(yáng)性對(duì)照)、無(wú)菌水(陰性對(duì)照)和2 g·L-1的Lc-NKlysin-1a溶液，并于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h(枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24 h)，然后觀察并測(cè)量抑菌圈的直徑.

1.4抗菌肽Lc-NKlysin-1a的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)測(cè)定用無(wú)菌水配制2 g·L-1的Lc-NKlysin-1a溶液，通過(guò)二倍稀釋?zhuān)謩e配制成質(zhì)量濃度為1 000，500，250，125，62.5，31.25，16.625 μg·mL-1和8.312 5 μg·mL-1的抗菌肽溶液(備用)，調(diào)整菌液濃度至1×106CFU·mL-1，在96孔板中加入100 μL菌液，再分別加入100 μL不同質(zhì)量濃度的抗菌肽溶液、無(wú)菌水或2 g·L-1的卡那霉素，混合均勻，每孔設(shè)置3個(gè)重復(fù)，然后于37 ℃培養(yǎng)12 h，每孔再加入20 μL刃天青溶液(1.4 g·L-1)，培養(yǎng)2 h，觀察孔中的顏色變化.

1.5Lc-NKlysin-1a抗菌穩(wěn)定性的研究

1.5.1 不同溫度對(duì)抗菌肽抗菌活性的影響配制2 g·L-1的Lc-NKlysin-1a溶液，分別在25，40，60，80，100 ℃處理20 min，并通過(guò)瓊脂板擴(kuò)散法，于每孔分別加入8 μL不同溫度處理的抗菌肽溶液或無(wú)菌水(陰性對(duì)照)，每孔設(shè)3個(gè)重復(fù)，然后將培養(yǎng)皿倒置，于37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察并測(cè)量抑菌圈的直徑.

1.5.2 加熱時(shí)間對(duì)抗菌肽抗菌活性的影響為了檢測(cè)100 ℃下不同處理時(shí)間對(duì)抗菌肽抗菌活性的影響，本研究將Lc-NKlysin-1a(2 g·L-1)溶液在100 ℃下分別處理0，20，40，60，80 min，接著，通過(guò)瓊脂板擴(kuò)散法，于各孔中分別加入8 μL 以上處理的Lc-NKlysin-1a或無(wú)菌水(陰性對(duì)照)，每孔設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)4.1.

1.5.3 不同pH對(duì)抗菌肽抗菌活性的影響參考劉晶晶等人的方法處理抗菌肽[11]，即配制2 g·L-1的Lc-NKlysin-1a抗菌肽溶液，在分別用1 mol·L-1的HCl和1 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)pH至2，3，4，5，6，7，8，9，10后，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾(除菌)，再通過(guò)瓊脂板擴(kuò)散法，于各孔分別加入8 μL不同pH處理的抗菌肽溶液，每孔設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)4.1.

1.5.4 不同鹽濃度對(duì)抗菌肽抗菌活性的影響分別用0.5，1，1.5，2 mol·L-1的無(wú)菌氯化鈉溶液配制2 g·L-1的Lc-NKlysin-1a溶液，再通過(guò)瓊脂板擴(kuò)散法，分別于各孔加入8 μL不同鹽濃度處理的抗菌肽溶液和無(wú)菌水(陰性對(duì)照)，每孔設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)4.1.

1.6抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌曲線(xiàn)將金黃色葡萄球菌單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h，調(diào)整細(xì)菌懸液至1×106CFU·mL-1，各取2.4 mL菌懸液，分別加入800 μL 125 μg·mL-1和62.25 μg·mL-1的Lc-NKlysin-1a溶液(終質(zhì)量濃度分別為31.25，15.625 μg·mL-1)或無(wú)菌水，混勻，并于37℃振蕩培養(yǎng)，然后分別在0，30，60，120，180 min取菌液并涂布培養(yǎng)，最后計(jì)數(shù)菌落數(shù).

1.7抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響取大腸桿菌、抗鏈霉素大腸桿菌和金黃色葡萄球菌單菌落，并將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，然后取750 μL菌液，加入Lc-NKlysin-1a溶液，使其終濃度為4×MIC，接著，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)1 h，然后以5 000 r·min-1離心3 min，取上清，以磷酸緩沖液洗2次，再加入φ=4%的戊二醛，于4 ℃固定8 h，離心，以磷酸緩沖液洗2次；接著加入φ=2%的戊二醛，于4 ℃固定1 h，離心，以磷酸緩沖液洗2次；最后，依次用體積分?jǐn)?shù)為20%，50%，80%，100%的乙醇梯度脫水，每次10 min，然后取菌懸液，將其滴到錫箔紙上，待乙醇揮發(fā)干后，用掃描電鏡觀察.

1.8抗菌肽Lc-NKlysin-1a的溶血活性取新鮮兔子血液，在3 500 r·min-1下離心10 min，棄上清，以生理鹽水洗細(xì)胞，直至上清透亮，然后用生理鹽水稀釋細(xì)胞至2×107CFU·mL-1，并以二倍稀釋法制備質(zhì)量濃度分別為400，200，100，50，25，12.5，6.25 μg·mL-1的Lc-NKlysin-1a溶液，以w=0.1%的SDS溶液和生理鹽水分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，將不同質(zhì)量濃度的抗菌肽溶液和紅細(xì)胞溶液按V抗菌肽∶V細(xì)紅胞=1∶1混合，于37 ℃孵育1 h，再在3 500 r·min-1下離心10 min，取上清，最后于405 nm處測(cè)吸光值，計(jì)算溶血率.

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 19對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并通過(guò)單樣品T檢驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)差異.

2 結(jié) 果

2.1抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌活性抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)大腸桿菌、抗鏈霉素大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌均具有抑菌活性(表1)，其中，抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑最小(圖1)，這說(shuō)明抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性較好，但對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性則相對(duì)較弱.

表1 抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)不同細(xì)菌的抑菌圈直徑

1： 2 g·L-1 的Lc-NKlysin-1a ； 2： 2 g·L-1的卡那霉素 ； 3： 無(wú)菌水

2.2抗菌肽Lc-NKlysin-1a的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC) 抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)大腸桿菌、抗鏈霉素大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性較好，MIC值較低(在15.625～31.25 μg·mL-1的范圍)，其對(duì)綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌活性亦相對(duì)較低，MIC在62.5～125 μg·mL-1之間(表2)，此結(jié)果與抑菌圈直徑的測(cè)量結(jié)果相符.

表2 抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)不同細(xì)菌的最低抑菌質(zhì)量濃度

2.3抗菌肽Lc-NKlysin-1a的穩(wěn)定性研究

2.3.1 不同溫度對(duì)抗菌肽抗Lc-NKlysin-1a抗菌活性的影響不同溫度處理后，抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)大腸桿菌、抗鏈霉素大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別約為4.5 mm，5.5 mm，6.3 mm，與室溫檢測(cè)的抑菌圈直徑差別不大，這說(shuō)明溫度對(duì)抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌活性沒(méi)有顯著影響(p>0.05)(圖2).

2.3.2 在100 ℃下不同處理時(shí)間對(duì)抗菌肽Lc-NKlysin-1a抗菌活性的影響圖3顯示，在100 ℃處理0，20，40，60，80 min后，抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)大腸桿菌、抗鏈霉素大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別約為4.5 mm，6.5 mm，6.5 mm；在100 ℃下處理20，40，60，80 min后，抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)抗鏈霉素大腸桿菌的抗菌活性較其在常溫條件下的活性有極顯著的提高；抗菌肽在100 ℃下處理20，40，60 min后，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性較其在常溫條件下的活性沒(méi)有顯著的影響，但在處理80 min后，卻具有顯著的提高；在100 ℃下處理40，60，80 min后，抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)大腸桿菌的抗菌活性相較于其在常溫條件下的活性具有極顯著的提高.實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，在100 ℃下處理抗菌肽Lc-NKlysin-1a一定時(shí)間后，抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌活性具有一定的提高.

2.3.3 不同pH值對(duì)抗菌肽Lc-NKlysin-1a抗菌活性的影響pH在2.0～10.0時(shí)，抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)大腸桿菌、抗鏈霉素大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抗菌活性，它對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和抗鏈霉素大腸桿菌產(chǎn)生最大抑菌圈的pH值分別為7，2和9.抗菌肽Lc-NKlysin-1a在pH為2.0～10.0的環(huán)境下仍能維持較高的抗菌活性(圖4)，這說(shuō)明抗菌肽Lc-NKlysin-1a在酸性、堿性和中性條件下都具有抗菌活性.

2.3.4 不同鹽濃度對(duì)抗菌肽Lc-NKlysin-1a抗菌活性的影響對(duì)于大腸桿菌，隨著鹽濃度的增加，抑菌圈的直徑逐漸減??；而對(duì)抗鏈霉素大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，隨著鹽濃度的增加，抑菌圈的直徑卻先增加后減小，且當(dāng)鹽濃度為1 mol·L-1時(shí)，抑菌圈的直徑達(dá)到最大，此時(shí)，抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌活性最強(qiáng)(圖5).

2.4抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌曲線(xiàn)抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌作用具有濃度依賴(lài)特點(diǎn)，隨著抗菌肽濃度的增加，其對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌程度逐漸增加.用0.5×MIC和1×MIC的抗菌肽Lc-NKlysin-1a處理金黃色葡萄球菌后，在180 min內(nèi)細(xì)菌數(shù)量緩慢下降；而用1×MIC的抗菌肽對(duì)其進(jìn)行處理后，在30 min內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量則迅速減少，至180 min，細(xì)菌數(shù)量仍持續(xù)緩慢地下降(圖6).

2.5抗菌肽Lc-NKlysin-1a對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響對(duì)于用無(wú)菌水處理的大腸桿菌、抗鏈霉素大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，其細(xì)菌的形態(tài)完整，且未見(jiàn)細(xì)胞損傷；但用4×MIC的抗菌肽Lc-NKlysin-1a處理1 h后，卻發(fā)現(xiàn)3種細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生了改變(圖7).

2.6抗菌肽Lc-NKlysin-1a的溶血活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)抗菌肽Lc-NKlysin-1a的質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg·mL-1時(shí)，其對(duì)兔紅細(xì)胞的溶血率達(dá)到最大，為11.83%，當(dāng)其質(zhì)量濃度為最低抑菌質(zhì)量濃度時(shí)，其溶血率在4.09%～7.37%之間，溶血活性較低.

3 討 論

近年來(lái)，對(duì)海洋生物的研究雖然取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但與陸地生物相比，對(duì)其的研究仍顯落后，尤其是有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能的抗菌肽，對(duì)其的發(fā)掘和研究顯得更為滯后.海洋來(lái)源的抗菌肽往往具有較強(qiáng)的紅細(xì)胞溶解活性[12].因此，需重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化抗菌肽分子，這樣就可以降低其細(xì)胞毒性，增強(qiáng)其生物活性，降低其生產(chǎn)成本[13].抗菌肽Lc-NKlysin-1a為海洋大黃魚(yú)抗菌肽Lc-NKlysin-1的衍生物，為其N(xiāo)末端12個(gè)氨基酸殘基序列.Zhou等人的研究顯示，抗菌肽Lc-NKlysin-1對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和哈氏弧菌具有抗菌活性；對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和哈氏弧菌的最低抑菌質(zhì)量濃度范圍為35.688～71.376 μg·mL-1；對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度范圍為71.376～142.752 μg·mL-1[6].而其衍生物L(fēng)c-NKlysin-1a不僅對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和副溶血弧菌具有抗菌活性，而且對(duì)銅綠假單胞菌和耐藥菌抗鏈霉素大腸桿菌也具有抗菌活性，這說(shuō)明該抗菌肽具有更廣的抗菌譜.Lc-NKlysin-1a對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和抗鏈霉素大腸桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度范圍為15.625～31.25 μg·mL-1，對(duì)副溶血弧菌的最低抑菌質(zhì)量濃度范圍為31.25～62.5 μg·mL-1，對(duì)銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度范圍為62.5～125 μg·mL-1.相對(duì)于其模板抗菌肽Lc-NKlysin-1，其衍生物L(fēng)c-NKlysin-1a對(duì)細(xì)菌的最低抑菌質(zhì)量濃度更小，抗菌活性更好，且隨著Lc-NKlysin-1a的相對(duì)分子質(zhì)量降低，其合成成本也相應(yīng)降低.

傳統(tǒng)抗生素是通過(guò)作用于細(xì)菌的生理代謝過(guò)程和破壞細(xì)菌的正常代謝而起到抗菌作用的，然而，細(xì)菌可以通過(guò)改變自身的基因構(gòu)成和調(diào)整藥物作用的靶點(diǎn)等方式來(lái)避開(kāi)多種抗生素的作用，從而產(chǎn)生耐藥性[14].抗菌肽可以以?xún)煞N方式作用于細(xì)菌，即胞內(nèi)作用和膜作用[15-16]，在通過(guò)胞內(nèi)作用時(shí)，抗菌肽可透過(guò)細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后作用于細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)，破壞細(xì)胞內(nèi)的正常代謝，從而使細(xì)菌死亡，這與傳統(tǒng)抗生素的作用方式相似；在膜作用時(shí)，抗菌肽通過(guò)所帶正電荷與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合，其兩性結(jié)構(gòu)使其可以結(jié)合到細(xì)胞膜，進(jìn)而使細(xì)胞膜穿孔，破壞其完整性，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物外溢和使細(xì)菌死亡[17].多數(shù)抗菌肽以膜作用方式作用于細(xì)菌，抗菌肽與細(xì)胞壁的這種非特異性結(jié)合，使細(xì)菌對(duì)抗菌肽不易產(chǎn)生耐藥性[18].通過(guò)掃描電鏡的觀察可知，抗菌肽Lc-NKlysin-1a是通過(guò)作用于細(xì)菌細(xì)胞膜和破壞其結(jié)構(gòu)來(lái)使其發(fā)生褶皺、坍塌和形成穿孔并最終使胞內(nèi)物質(zhì)外流而致使細(xì)菌死亡的，因此，Lc-NKlysin-1a主要是通過(guò)膜作用方式來(lái)作用于細(xì)菌的，至于其是否同時(shí)伴有其他的抗菌機(jī)制，這還有待于今后更深入的研究.

抗菌肽Lc-NKlysin-1a具有廣譜抗菌活性，它對(duì)大腸桿菌、抗鏈霉素大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性最好，其最低抑菌質(zhì)量濃度在15.625～31.25 μg·mL-1的范圍內(nèi).抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌活性在25 ℃～80 ℃的范圍內(nèi)較穩(wěn)定，但在100 ℃下，不同處理時(shí)間對(duì)其抗菌活性有一定的促進(jìn)作用；不同pH值對(duì)Lc-NKlysin-1a抗菌活性的影響不大；在不同鹽濃度下，Lc-NKlysin-1a對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性較穩(wěn)定，然而，鹽濃度的增加卻對(duì)抗鏈霉素大腸桿菌的抗菌活性具有顯著的促進(jìn)作用.抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌譜廣，其對(duì)耐藥菌具有抗菌活性，且具有穩(wěn)定性好，溶血活性低，相對(duì)分子質(zhì)量小等特點(diǎn)，這使其具有能被開(kāi)發(fā)成抗菌肽藥物的良好潛力.

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AntimicrobialStabilityandMechanismofAntimicrobialPeptideLc-NKlysin-1a

Luo Wenjie, Zhong Hengren, He Lulu, Shao Jiaqi, Song Yanting, Zhang Yingxia

(Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, College of Marine Science, Hainan University, Haikou 570228, China)

The antimicrobial peptide, Lc-NKlysin-1, was obtained from marine fish, the large yellow croaker (Larimichthys crocea). In the report, in order to study the relationship between structure and function of Lc-NKlysin-1, Lc-NKlysin-1a (12 N-terminal amino acid residues of Lc-NKlysin-1) was designed and synthesized. The effects of temperature, pH and salt concentration on antibacterial activity of Lc-NKlysin-1a were determined by agar plate drilling method. The hemolytic activity of Lc-NKlysin-1a was measured by hemoglobin releasing method. The minimum inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial peptide was determined by two fold dilution method. The growth curve was drawn to analyze the antimicrobial characteristics of Lc-NKlysin-1a. Under scanning electron microscope, the effects of Lc-NKlysin-1a on the morphology and structure of bacteria was observed. The results indicated that Lc-NKlysin-1a has the antimicrobial activities against Gram-positive strains,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis, and Gram-negative strains,Escherichiacoli,Pseudomonasaeruginosa,Vibrioand streptomycin-resistentE.coli. And the MIC of Lc-NKlysin-1a againstS.aureus,E.coli, and streptomycin-resistantE.coliwere 15.625-31.25 μg.mL-1. The antimicrobial activities of Lc-NKlysin-1a were stronger than that of Lc-NKlysin-1. Lc-NKlysin-1a had high stability against temperature, pH and salt concentration. After being treated with Lc-NKlysin-1a, the cell membrane was folded and collapsed, and leading to cell death. The higher antimicrobial activity, lower molecular mass and stabilities of Lc-NKlysin-1a make it to be a promising candidate of novel antimicrobial agents or models for the development of novel antimicrobial peptides.

antimicrobial peptide;Larimichthyscrocea; antimicrobial activity; stability; mechanism

2017-07-11

國(guó)家自然科學(xué)基金(31560593)；海南大學(xué)省級(jí)特色重點(diǎn)學(xué)科—藥學(xué)(海洋藥物)研究生創(chuàng)新課題

羅文杰(1992 - )，男，安徽太和人，海南大學(xué)海洋學(xué)院2015級(jí)碩士研究生，E-mail:1806428111@qq.com

張英霞( 1973 - ) ，女，吉林集安人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向: 動(dòng)物活性蛋白與多肽，E-mail: yingxiazhang@hotmail.com

1004-1729(2017)04-0345-07

R 931.74

ADOl10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0053