王敏珠，李曉丹，胡遠(yuǎn)艷，魏小斌，符先先，羅素蘭，長孫東亭

(1.海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口市海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228; 2.?？谑腥嗣襻t(yī)院檢驗(yàn)科，海南 海口570228)

對(duì)于αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]安全性的評(píng)價(jià)

王敏珠1，李曉丹1，胡遠(yuǎn)艷1，魏小斌2，符先先2，羅素蘭1，長孫東亭1

(1.海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228; 2.?？谑腥嗣襻t(yī)院檢驗(yàn)科，海南 海口570228)

為了初步評(píng)價(jià)αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]的安全性，以昆明種( KM )小鼠為受試動(dòng)物，于給藥組連續(xù)7天對(duì)每只小鼠肌肉注射10 nmol的αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2], 對(duì)照組則給予等容積的生理鹽水.實(shí)驗(yàn)期間監(jiān)測(cè)小鼠的體重變化，觀察小鼠的毒性反應(yīng)，給藥結(jié)束后，即第8天摘除其眼球并采血，檢測(cè)小鼠的血常規(guī)、血液生化等指標(biāo)，同時(shí)剖取其主要臟器，稱重后計(jì)算臟器系數(shù)，并以此來評(píng)價(jià)GeXIVA[1,2]的毒性作用，然后對(duì)該藥物劑量的安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià).結(jié)果顯示：GeXIVA[1,2]組的小鼠與生理鹽水組相比較，小鼠活動(dòng)正常，且未見明顯的毒性反應(yīng)或死亡現(xiàn)象；實(shí)驗(yàn)期間給藥組小鼠在各個(gè)觀察時(shí)間的體重與對(duì)照組比較均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)；給藥組與陰性組在血常規(guī)檢查、血生化檢測(cè)、臟器系數(shù)(%)等方面均無顯著性差異(P>0.05).由此認(rèn)為，在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]的安全性好，且無明顯的毒副作用.

αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]； 安全性評(píng)價(jià)； 小鼠

海洋藥物是21世紀(jì)藥學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]，它為中國海洋藥物研究與開發(fā)提供了契機(jī)[2].我國海域遼闊，海岸線漫長，具有豐富的海洋生物資源，海洋生物資源中的活性物質(zhì)又是發(fā)展天然藥物和治療常見疾病與疑難雜癥的理想藥物.從海洋無脊椎動(dòng)物中所分離的活性物質(zhì)在天然化合物中占有較大的比例, 并且許多海洋化合物已被用于臨床試驗(yàn)[3-5]，它們?cè)阪?zhèn)痛、戒煙和戒毒以及治療帕金森癥、精神病等重大疾病方面具有極好的應(yīng)用前景[6].芋螺毒素 ( Conotoxin,Conopeptide)是由生活在熱帶海洋中的肉食性軟體動(dòng)物—芋螺(Conus)的毒腺所分泌出來的活性多肽，一般由12～46個(gè)氨基酸殘基組成，它能特異性地作用于動(dòng)物體內(nèi)的各種離子通道和細(xì)胞膜上神經(jīng)遞質(zhì)與激肽的受體，具有種類多、相對(duì)分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)多樣、作用靶點(diǎn)廣泛、功能專一、作用快等特性[7-11].在海南，生活于熱帶海洋中的芋螺是我國寶貴的藥用海洋生物資源，它對(duì)于海洋創(chuàng)新藥物的研究與開發(fā)具有非常重要的作用.本實(shí)驗(yàn)室所發(fā)現(xiàn)的αO-芋螺毒素GeXIVA[12]是來自中國南海食蟲芋螺(Conusgeneralis)的新家族—芋螺毒素.αO-芋螺毒素GeXIVA是由28個(gè)氨基酸殘基組成，它含有4個(gè)半胱氨酸殘基，分別有兩對(duì)二硫鍵，有3種可能的二硫鍵異構(gòu)體[12].其中，活性最強(qiáng)的異構(gòu)體是GeXIVA[1,2]，它的二硫鍵連接方式為Cys2-Cys9, Cys20-Cys27 (bead isomer)(圖1)，分子質(zhì)量為3 452 Da.GeXIVA[1,2]是選擇性作用于α9α10煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)的強(qiáng)阻斷劑，其半阻斷劑量 ( IC50)僅為3.8 nmol[12].α9α10 nAChRs已被認(rèn)為是治療慢性痛(神經(jīng)痛)的藥物作用靶點(diǎn)[12-14].GeXIVA[1,2]在坐骨神經(jīng)慢性擠壓性損傷(CCI)神經(jīng)病理性疼痛模型上的鎮(zhèn)痛活性強(qiáng)，且無成癮性，停藥后其鎮(zhèn)痛活性依然能維持較長的時(shí)間.GeXIVA[1,2]作為新型的鎮(zhèn)痛候選新藥，具有強(qiáng)效性、無耐受性、對(duì)運(yùn)動(dòng)功能無影響等優(yōu)點(diǎn)，有望為廣大神經(jīng)痛患者帶來福音[15].鑒此，本研究對(duì)小鼠連續(xù)7天通過肌肉注射了GeXIVA[1,2]，并對(duì)其安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期為其在臨床上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種(KM)小鼠，雌雄各半，體重20～22 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證：SCXK(湘)2013-0004)，在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)時(shí)，隨機(jī)分組，每籠5只，小鼠常規(guī)進(jìn)食且自由飲水，實(shí)驗(yàn)室濕度為40%～60%，溫度保持在(23±1)℃，晝夜交替(12 h照明，12 h黑暗)，風(fēng)速為0.1～0.2 m/s，氣流≥28 h-1.

1.2GeXIVA[1,2]的化學(xué)合成采用Fmoc固相合成法合成αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]線性樹脂肽[16].即從固相載體除去線性肽(切割樹脂及側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，用-20 ℃冰乙醚)，然后離心并洗滌3次，在獲得線性肽沉淀后，進(jìn)一步用HPLC純化，接著對(duì)純化后的線性肽進(jìn)行兩步氧化折疊，如此可獲得二硫鍵定點(diǎn)連接的氧化肽[17].第一步氧化折疊是在0.1 mol·L-1的 NH4HCO3( pH=8.2)緩沖液中進(jìn)行，線性肽的濃度為0.1 μmol·L-1，氧化折疊后就形成了第一對(duì)二硫鍵，即單環(huán)肽.此后，用碘氧化單環(huán)肽而形成第二對(duì)二硫鍵, 即雙環(huán)肽GeXIVA[1,2] (圖1)，并在通過HPLC分離純化和質(zhì)譜鑒定后將其用于后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn).

圖1 αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]的序列及其二硫鍵的連接方式

1.3連續(xù)7天給藥的安全性評(píng)價(jià)受試動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，挑選健康成年小鼠40只(雌雄各半)，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和GeXIVA[1,2]給藥組(雌雄各10只).給藥組的每只小鼠連續(xù)7天肌肉注射10 nmol的GeXIVA[1,2], 對(duì)照組則給予等容積的生理鹽水.試驗(yàn)前動(dòng)物禁食過夜，自由飲水，給藥后給予正常飲食.每日觀察動(dòng)物的外觀、體征和行為活動(dòng)、糞便、食量、呼吸、消化、循環(huán)及神經(jīng)系統(tǒng)等的臨床癥狀或體征.分別于第1，3，5，7天稱體重1次，觀察動(dòng)物的體重變化.于給藥結(jié)束后(第8天)，摘除其眼球并采血，分別使用含有乙二胺四乙酸二鉀(K2EDTA)和肝素鋰的真空采血管收集血液，然后進(jìn)行血液學(xué)及血液生化學(xué)方面的檢測(cè)(由?？谑腥嗣襻t(yī)院檢驗(yàn)科化驗(yàn))，同時(shí)剖檢和觀察主要臟器.

檢測(cè)指標(biāo)包括: 白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白量(MCH)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、淋巴細(xì)胞數(shù)(LYMPH)、RDW-CV、血小板分布寬度(PDW)、平均血小板體積(MPV)、尿素(Bun)、肌酐(CREA)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST).

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SEM)表示，同時(shí)采用GraphPadPrism5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖，分析和比較各組動(dòng)物的體重、臟器；血常規(guī)及血生化的各項(xiàng)指標(biāo)則采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1一般毒性表現(xiàn)雌性、雄性KM小鼠經(jīng)大腿肌肉注射GeXIVA[1,2]后，實(shí)驗(yàn)期間小鼠狀況良好，運(yùn)動(dòng)及行為正常，無死亡，未觀察到明顯的中毒癥狀.

2.2芋螺多肽GeXIVA[1,2]對(duì)KM小鼠體重的影響連續(xù)7天肌肉注射GeXIVA[1,2]和生理鹽水，分別于第1，3，5，7天記錄小鼠的體重，結(jié)果如圖2所示.給藥期間，隨著時(shí)間的增加，給藥組小鼠和生理鹽水對(duì)照組小鼠的體重均逐漸增加.給藥組小鼠的平均體重從(26.57±2.07)g增加到(33.10±3.45)g；生理鹽水組小鼠的平均體重從(26.10±1.98)g增加到(33.86±3.67)g；雖然生理鹽水組小鼠的體重增長速度比藥物組的稍快，但它們之間各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)的體重差異均無顯著性差異(P>0.05)(圖2)，可見，連續(xù)7天肌肉注射10 nmol的GeXIVA[1,2]對(duì)小鼠的體重增長未見明顯的影響.

2.3GeXIVA[1,2]對(duì)KM小鼠臟器系數(shù)(%)的影響連續(xù)給藥7天后，第8天進(jìn)行剖檢，摘取心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，然后進(jìn)行肉眼觀察，接著剔除脂肪和筋膜，用濾紙吸干其表面的液體，稱重并計(jì)算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=臟器重量(g)/體重(g)×100%，其結(jié)果如圖3所示.連續(xù)7天肌肉注射10 nmol的GeXIVA[1,2]后，給藥組小鼠的主要臟器系數(shù)分別為：(0.60±0.11)%(心)、(5.99±0.75)%(肝)、(0.49±0.13)%(脾)、(0.69±0.08%)(肺)、(1.55±0.28)%(腎)；對(duì)照組小鼠的主要臟器系數(shù)分別為：(0.61±0.12)%(心)、(5.91±0.80%)(肝)、(0.69±0.41%)(脾)、(0.71±0.08%)(肺)、(1.53±0.25)%(腎)，由上述可見，給藥組與對(duì)照組小鼠的主要臟器系數(shù)相比較，二者均無顯著性差異(P>0.05).剖檢過程中，經(jīng)肉眼觀察，各臟器沒有出現(xiàn)浴血和充血的現(xiàn)象，亦無明顯的病變.

2.4GeXIVA[1,2]對(duì)KM小鼠血常規(guī)的影響使用含有乙二胺四乙酸二鉀(K2EDTA)的真空采血管收集血液樣品(每只0.5～1.0 mL/管)，冰浴保存，并于當(dāng)天進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示.GeXIVA[1,2]給藥組的白細(xì)胞數(shù)[(5.36±0.52)×109·L-1]與對(duì)照組的白細(xì)胞數(shù)[(5.45±0.69)×109·L-1]比較，其間的差異只有0.09×109·L-1，差異不顯著；給藥組的紅細(xì)胞數(shù)[(8.03±0.95)×1012·L-1]與對(duì)照組的紅細(xì)胞數(shù)[(8.02±1.13)×1012·L-1]比較，其間的差異只有0.01×1012·L-1，差異不顯著；血紅蛋白值相差也只有0.72 g·L-1，差異不顯著，其他各項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目的差異也比較小，都在誤差范圍內(nèi)[18].連續(xù)7天肌肉注射10 nmol的芋螺毒素GeXIVA[1,2]組與陰性對(duì)照組相比較，血液學(xué)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均未出現(xiàn)顯著性的變化(P>0.05).

表1 GeXIVA[1,2]組和生理鹽水組小鼠的血常規(guī)檢查指標(biāo)值(Mean±SEM，n=20)

2.5GeXIVA[1,2]對(duì)KM小鼠血液生化指標(biāo)的影響使用含有肝素鋰的真空采血管收集血液樣品，每只(1.5～2.0) mL/管，冰浴保存，當(dāng)天進(jìn)行血液生化檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示.GeXIVA[1,2]給藥組尿素的含量為(7.06±1.24)mmol/L，與對(duì)照組尿素的含量[(5.39±0.99)mmol/L]進(jìn)行比較，其間的差異為1.67 mmol/L，二者之間的差異不顯著.給藥組谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量為(109.20±27.45)U/L，與對(duì)照組谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量[(104.30±18.26)U/L]相比較，其間的差異只有4.90 U/L，二者之間的差異無顯著性.其他各項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目的指標(biāo)值均在波動(dòng)范圍內(nèi)[18]，均無顯著性差異.芋螺毒素GeXIVA[1,2]組的各項(xiàng)血清生化指標(biāo)，包括尿素、肌酐、膽固醇、甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等，與生理鹽水對(duì)照組的各項(xiàng)血清生化指標(biāo)相比較，均無顯著性差異(P>0.05).

表2 GeXIVA[1,2]組和生理鹽水組小鼠的血生化檢查指標(biāo)值(Mean±SEM，n=20)

3 討 論

海洋中蘊(yùn)藏著豐富的天然生物活性物質(zhì)，從資源研究上看，目前用于研究的海洋生物僅有幾千種，這表明海洋生物還具有巨大的研究與開發(fā)潛力[5]，其中，有些生物活性物質(zhì)具有重要的藥用價(jià)值，它們已成為人類治愈疾病的重要藥物資源，如多肽?？舅?，它已被作為自身免疫性疾病和強(qiáng)心藥物的重要先導(dǎo)化合物[19-23].目前已經(jīng)上市的芋螺毒素藥物—齊考諾肽(ω-MVIIA),其主要被用于癌癥和艾滋病晚期的頑固性疼痛治療，療效確切，不成癮，比成癮性極強(qiáng)的鴉片類鎮(zhèn)痛劑具有明顯的優(yōu)勢(shì)[10, 24-26]，但是，由于齊考諾肽是通過阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的N-型鈣離子通道來發(fā)揮其鎮(zhèn)痛效果的，它要求鞘內(nèi)中樞給藥，給藥途徑很麻煩，因而開發(fā)給藥途徑更方便(如肌肉注射)的新型無成癮性鎮(zhèn)痛藥將具有更加廣闊的市場(chǎng)前景.現(xiàn)已證明，α9α10 nAChRs主要分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)中，與痛覺信號(hào)的傳遞有關(guān)[27]，作用于該受體的α-芋螺毒素Vc1.1、RgIA等在慢性疼痛神經(jīng)病理性疼痛模型上顯示了良好的鎮(zhèn)痛效果[7, 28-30].先前研究的結(jié)果顯示，αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]是選擇性地作用于α9α10 nAChRs，它在大鼠慢性壓迫性神經(jīng)損傷模型上呈現(xiàn)出很好的鎮(zhèn)痛活性，且不成癮[12, 15].研究表明，α-芋螺毒素Vc1.1與RgIA對(duì)大鼠α9α10 nAChR的阻斷活性強(qiáng)，但對(duì)人類α9α10 nAChR的阻斷活性卻很弱[31]，這不利于用于人類神經(jīng)痛的治療.然而，αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]對(duì)大鼠和人類的α9α10 nAChRs的阻斷活性都很強(qiáng)[32]，因此，αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]可作為一個(gè)新型的海洋多肽類藥物，它在治療神經(jīng)病理性疼痛方面具有廣闊的開發(fā)前景.

在藥物的開發(fā)過程中，通過重復(fù)給藥的動(dòng)物試驗(yàn)來表征其對(duì)受試物的毒性作用，這是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的核心內(nèi)容，它與急性毒性、生殖毒性以及致癌性等毒理學(xué)研究有著密切的聯(lián)系，是藥物從藥學(xué)研究進(jìn)入臨床試驗(yàn)的重要環(huán)節(jié).重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)所獲得的信息對(duì)長期毒性試驗(yàn)劑量的設(shè)計(jì)和某些藥物Ⅰ期臨床試驗(yàn)起始劑量的選擇具有重要的參考價(jià)值，它對(duì)于預(yù)測(cè)其可能對(duì)人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，降低臨床試驗(yàn)受試者和藥品上市后使用人群的用藥風(fēng)險(xiǎn)具有重要的指導(dǎo)意義.為此，本研究選用昆明種小鼠作為受試對(duì)象，連續(xù)7天于其體上肌肉注射GeXIVA[1,2]，并以生理鹽水作為對(duì)照，仔細(xì)觀察了小鼠的毒性反應(yīng)，然而卻未見小鼠有蜷臥、聳毛、耳蝸蒼白或充血、呼吸困難、肌肉癱瘓、昏迷等明顯的毒性反應(yīng)或死亡現(xiàn)象.試驗(yàn)期間，給藥組小鼠在各個(gè)觀察時(shí)間的體重與對(duì)照組比較均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異.給藥停止后，于第8天摘除其眼球并采血，然后檢測(cè)血常規(guī)和生化值，剖檢和觀察其主要臟器，并對(duì)臟器稱重和計(jì)算臟器系數(shù)，因臟器重量及臟器系數(shù)是衡量動(dòng)物功能狀態(tài)的重要指標(biāo)，同時(shí)也是在對(duì)藥物進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)的指定檢測(cè)項(xiàng)目.盡管小鼠血液學(xué)及血生化指標(biāo)的使用頻率沒有大鼠的高，但在涉及相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，這些指標(biāo)同樣具有相當(dāng)大的參考價(jià)值[33].血液生理和其生化指標(biāo)是毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用于評(píng)價(jià)藥物安全性的測(cè)評(píng)指標(biāo)，通過衡量機(jī)體血液成分在受試藥物作用下有無改變和血液生化指標(biāo)的變化情況，可推斷出受試藥物對(duì)機(jī)體臟器功能有無影響，從而可確定受試藥物的毒性大小[33-34].本實(shí)驗(yàn)中，GeXIVA[1,2]給藥組小鼠與生理鹽水對(duì)照組的血常規(guī)指標(biāo)均無顯著性差異，表明連續(xù)7天給藥對(duì)小鼠血液生理指標(biāo)無明顯影響.同時(shí)給藥組的肝腎功能測(cè)試指標(biāo)[尿素(Bun)、肌酐(CREA)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)]與對(duì)照組的相應(yīng)指標(biāo)比較，二者差異也不顯著，說明連續(xù)7天給予的GeXIVA[1,2]對(duì)小鼠的肝腎功能無不良影響.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床血液學(xué)及生化指標(biāo)對(duì)生物醫(yī)學(xué)、病理學(xué)、毒理學(xué)的研究具有非常重要的參考價(jià)值，它不僅對(duì)動(dòng)物正常生理狀態(tài)的判定有指導(dǎo)意義，而且也是對(duì)食品、藥品、化學(xué)物質(zhì)等進(jìn)行毒理學(xué)方面的安全性評(píng)價(jià)以及在人類疾病研究中探討發(fā)病機(jī)理的重要指標(biāo)和依據(jù).本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果顯示，連續(xù)7天肌肉注射αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]后，未見小鼠有明顯的毒性反應(yīng)，這說明αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]在所測(cè)試的劑量范圍內(nèi)，不會(huì)在小鼠體內(nèi)引起明顯的毒性反應(yīng)，因此該給藥劑量較為安全.

4 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]對(duì)小鼠的主要臟器及血液指標(biāo)無明顯的毒副作用，因此它可作為后期毒理學(xué)研究和進(jìn)一步的安全性評(píng)價(jià)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

[1] 關(guān)美君,林文翰,丁源.海洋藥物——二十一世紀(jì)中國藥學(xué)研究的新熱點(diǎn)[J].中國海洋藥物，2001, 20(1):1-5.

[2] 羅素蘭,張本,長孫東亭,等.海洋藥物研究新進(jìn)展及其開發(fā)戰(zhàn)略[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003, 21(4):365-370.

[3] Newman D J, Cragg G M. Marine-sourced anti-cancer and cancer pain control agents in clinical and late preclinical development[J].Marine Drugs,2014, 12(1):255-278.

[4] Petit K, Biard J F. Marine natural products and related compounds as anti-cancer agents: an overview of their clinical status[J].Anti-cancer agents in medicinal chemistry,2013, 13(4):603-631.

[5] 姜山,李化苓,邵磊.近幾年海洋藥物的臨床應(yīng)用與研究[J].中國海洋藥物，2001, 20(1):42-45.

[6] 羅素蘭,長孫東亭,吳勇,等.海南產(chǎn)芋螺毒素在疼痛與成癮治療中的應(yīng)用前景[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2012, 26(3):439-440.

[7] Mannelli LDC, Cinci L, Micheli L, et al. α-Conotoxin RgIA protects against the development of nerve injury-induced chronic pain and prevents both neuronal and glial derangement[J].Pain, 2014, 155(10):1986-1995.

[8] Luo Sulan, Zhangsun D T, Wu Yong,et al. Characterization of a novel alpha-conotoxin fromConustextile that selectively targets alpha 6/alpha 3 beta 2 beta 3 nicotinic acetylcholine receptors[J].Journal of Biological Chemistry,2013, 288(2):894-902.

[9] Robinson S D, Norton R S. Conotoxin Gene Superfamilies[J].Marine Drugs,2014,12(12):6058-6101.

[10] Rigo F K, Dalmolin G D, Trevisan G,et al. Effect ofω-conotoxin MVIIA and Phα1βon paclitaxel-induced acute and chronic pain[J].Pharmacology Biochemistry and Behavior,2013, 114(115):16-22.

[11] Luo Sulan, Zhangsun D T, Schroeder C I, et al. A novel α4/7-conotoxin LvIA fromConuslividus that selectively blocksα3β2 vs.α6/α3β2β3 nicotinic acetylcholine receptors[J].Faseb Journal:Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology,2014, 28(4):1842-1853.

[12] Luo Sulan, Zhangsun D T, Harvey P J, et al. Cloning, synthesis, and characterization of αO-conotoxin GeXIVA, a potent α9α10 nicotinic acetylcholine receptor antagonist[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015,112(30):4026-4035.

[13] Vincler M, Wittenauer S, Parker R, et al. Molecular mechanism for analgesia involving specific antagonism of α9α10 nicotinic acetylcholine receptors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006, 103(47): 17880-17884.

[14] Romero H K, Christensen S B, Mannelli L D C, et al. Inhibition ofα9α10 nicotinic acetylcholine receptors prevents chemotherapy-induced neuropathic pain[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, 114(10):E1825.

[15] Li X D, Hu Y Y, Wu Y, et al. Anti-hypersensitive effect of intramuscular administration of αO-conotoxin GeXIVA[1,2] and GeXIVA[1,4] in rats of neuropathic pain[J].Progress in Neuro-psychopharmacology and Biological Psychiatry, 2016, 3(66): 112-119.

[16] Luo Sulan, Akondi K B, Zhangsun D T, et al. Atypical alpha-conotoxin LtIA from Conus litteratus targets a novel microsite of the alpha3beta2 nicotinic receptor[J].Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(16):12355-12366.

[17] Gyanda R, Banerjee J, Chang Y P, et al. Oxidative folding and preparation ofα-conotoxins for use in high-throughput structure-activity relationship studies[J].Journal of Peptide Science, 2013, 19(1):16-24.

[18] 胡建武,盧勝明,車路平,等.10種常見SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大、小鼠血液學(xué)及生化指標(biāo)正常參考值的探討[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2007,24(2):5-10.

[19] Blanchard MG, Rash LD, Kellenberger S. Inhibition of voltage-gated Na(+) currents in sensory neurones by the sea anemone toxin APETx2[J].British Journal of Pharmacology,2012, 165(7):2167-2177.

[20] Nesher N, Zlotkin E, Hochner B. The sea anemone toxin AdE-1 modifies both sodium and potassium currents of rat cardiomyocytes[J].Biochemical Journal,2014, 461(1):51-59.

[21] Zhang Y R, Wu Zongze, Luo L W, et al. Advances in researches on the pharmacological activity of sea anemone toxin[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2015, 43(28): 122-124.

[22] Beeton C, Chandy K G, Iadonato S P,et al. Development of the sea anemone toxin ShK-186 for the treatment of autoimmune diseases: PK and ADME perspectives[J].Toxicon,2012,60(2):114-114.

[23] Fu Liying, Li Yang, Cheng L, et al. Effect of sea anemone toxin anthopleurin-Q on sodium current in guinea pig ventricular myocytes[J].Acta Pharmacologica Sinica,2001,22(12):1107-1112.

[24] Rigo F K, Trevisan G, Rosa F,et al. Spider peptide Al phα1βinduces analgesic effect in a model of cancer pain[J].Cancer Science,2013, 104(9):1226-1230.

[25] Bozorgi H, Jahaniann-ajafabadi A, Rabbani M. The effect of intrathecal administration of the neuronal N-type calcium channels antagonist,ω-conotoxin MVIIA, on attenuating the spontaneous and naloxone-precipitated morphine withdrawal in rats[J].Toxin Reviews,2016(1-2):33-37.

[26] 長孫東亭,朱曉鵬,吳勇,等.ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC對(duì)α9α10乙酰膽堿受體的活性研究[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014,32(4):352-358.

[27] Del BA, Cesario A, Salinaro G,et al. Alpha9 alpha10 nicotinic acetylcholine receptors as target for the treatment of chronic pain[J].Current Pharmaceutical Design, 2014,20(38):6042-6047.

[28] Chhabra S, Belgi A, Bartels P,et al. Dicarba analogues ofα-conotoxin RgIA. structure, stability and activity at potential pain targets[J].Journal of Medicinal Chemistry, 2014,57(23):9933-9944.

[29] Pacini A, Micheli L, Maresca M,et al. The α9α10 nicotinic receptor antagonist α-conotoxin RgIA prevents neuropathic pain induced by oxaliplatin treatment[J].Experimental Neurology, 2016, 282:37-48.

[30] Yu R, Kompella S N, Adams D J,et al. Determination of the α-conotoxin Vc1.1 binding site on theα9α10 nicotinic acetylcholine receptor[J].Journal of Medicinal Chemistry, 2013,56(9):3557-3567.

[31] Azam L, Mclntosh J M. Molecular basis for the differential sensitivity of rat and humanα9α10 nAChRs toα-conotoxin RgIA[J]. Journal of Neurochemistry, 2012, 122(6):1137-1144.

[32] Zhangsun D T, Zhu X P, Kaas Q T, et al. αO-conotoxin GeXIVA disulfide bond isomers exhibit differential sensitivity for various nicotinic acetylcholine receptors but retain potency and selectivity for the humanα9α10 subtype[J]. Neuropharmacology,2017.

[33] 夏介英,雷培琪,曾曉蘭,等.SPF級(jí)KM小鼠主要臟器重量和血液生化值的測(cè)定[J].四川生理科學(xué)雜志，2009, 31(3): 104-107.

[34] 于業(yè)軍,仲偉珍,房麗華,等.海洋低溫堿性蛋白酶亞慢性毒理學(xué)研究[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2000, 21(4):75-86.

SafetyEvaluationofαO-ConotoxinGeXIVA[1,2]

Wang Minzhu1, Li Xiaodan1, Hu Yuanyan1, Wei Xiaobin2, Fu Xianxian2, Luo Sulan1, Zhangsun Dongting1

(1. Key Laboratory of Tropical Biological Resources, Ministry of Education, Key Lab for Marine Drug of Haikou, Hainan University, Haikou 570228, China;2. Haikou People’s Hospital, Haikou 570228, China)

In this report, to evaluate the safety and toxicology effects,αO-conotoxin GeXIVA[1,2] was intramuscular injected into KM mice for 7 days. The single dose was 10 nmol everyday, and equal volume of normal saline was injected as control. The changes of body weight were monitored during the administration, and the toxicity reactions of the mice were observed. After the last injection on the 8th day, the eyeball were removed and blood samples were collected, the effects of GeXIVA[1, 2] on blood routine, blood biochemical index were investigated, and the organs were collected and the coefficients were used to assess the safety. The results indicated that there were no obvious toxicity reactions observed in the GeXIVA[1,2] group; there were no significant differences between the weights of the mice of the GeXIVA[1,2] and that of the control group (P>0.05); as well as differences between the the blood regular parameters, biochemical indexes and organ coefficient (%) of the mice of the GeXIVA[1,2] and that of the control group (P>0.05). The conclusion can be drawn that during the dosage ranges in this work,αO-conotoxin GeXIVA[1,2] was safe.

αO-ConotoxinGeXIVA[1,2]; safety evaluation; mice

2017-06-01

國家自然科學(xué)基金(41366002, 81420108028)；海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZDKJ2016002)；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT_15R15)資助.

王敏珠(1989-)，男，海南儋州人，海南大學(xué)海洋學(xué)院2015級(jí)碩士研究生，E-mail: 1043782828@qq.com

長孫東亭，男，陜西永壽人，研究員，研究方向：海洋藥物與生物技術(shù)，E-mail: zhangsundt@163.com

1004-1729(2017)04-0352-07

R 99

ADOl10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0054