杜 穎 付丹妮 鄒益澤 白雪松 姜 震 程 功 紀(jì)明山祁之秋

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一種需要重點(diǎn)防治的真菌性病害，可侵染多種蔬菜和水果，對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重破壞（Jiang et al.，2009；張彩鳳 等，2013；張瑋 等，2013）。由于灰霉病菌的生命周期非常短，孢子產(chǎn)生量大，對(duì)防治藥劑極易產(chǎn)生抗藥性（Rosslenbroich & Stuebler，2000），如灰霉病菌對(duì)苯并咪唑類、二甲酰亞胺類及氨基甲酸酯類等殺菌劑的抗性已多見報(bào)道，抗性問題日趨嚴(yán)重（丁中等，2001；趙建江 等，2010；Zhang et al.，2011）。腐霉利屬于二甲酰亞胺類殺菌劑，于20世紀(jì)80年代在我國(guó)投入使用，雖應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)，但因其防效高、對(duì)作物安全等特點(diǎn)，目前依舊作為防治番茄灰霉病的主要藥劑（徐作珽 等，2001；石延霞 等，2016）。其抗性問題在遼寧省也較為突出，農(nóng)民在使用時(shí)往往會(huì)加大藥量來(lái)提高藥效，而由此造成的農(nóng)藥濫用問題十分普遍，還會(huì)引起農(nóng)藥殘留的潛在危害（趙曉軍 等，2010；宋晰 等，2013）。

在實(shí)際田間生產(chǎn)中，農(nóng)藥抗性問題復(fù)雜多變，需要及時(shí)對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)，更新數(shù)據(jù)，了解抗藥性現(xiàn)狀，以便做出準(zhǔn)確全面的評(píng)估（Leroux et al.，2002；Ma & Michailides，2005）。鑒于此，本試驗(yàn)采集了遼寧省8個(gè)地區(qū)的番茄灰霉病菌的田間種群，系統(tǒng)測(cè)定了115株番茄灰霉病單孢菌株對(duì)腐霉利的抗藥性，明確了當(dāng)前遼寧省各地區(qū)番茄灰霉病對(duì)腐霉利的抗藥性現(xiàn)狀，并探究了抗藥性的分子機(jī)制，以期對(duì)番茄灰霉病抗藥性治理及田間有效防治提供借鑒，并能指導(dǎo)農(nóng)民正確施藥，減少抗性藥劑的濫用，推動(dòng)農(nóng)藥減施。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藥劑為95%腐霉利（procymidone）原藥，由沈陽(yáng)化工研究院有限公司測(cè)試與評(píng)價(jià)中心提供。

供試菌株為番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）：2017年從遼寧省沈陽(yáng)、普蘭店、盤錦、葫蘆島、朝陽(yáng)、丹東、法庫(kù)、阜新等8個(gè)番茄栽培區(qū)采集番茄灰霉病病葉和病果，并于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行分離、純化和培養(yǎng)，單孢菌株低溫保存于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，共計(jì)獲得115株番茄灰霉病單孢菌株。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：稱取葡萄糖20 g、去皮馬鈴薯200 g，瓊脂條20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，煮沸，經(jīng)紗布過濾后所得液體于121 ℃下經(jīng)高壓蒸汽滅菌30 min，而后用于番茄灰霉病菌的培養(yǎng)保存以及對(duì)腐霉利敏感性的測(cè)定。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）：稱取葡萄糖20 g、去皮馬鈴薯200 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，煮沸，經(jīng)紗布過濾后所得液體于121 ℃下經(jīng)高壓蒸汽滅菌30 min，而后用于番茄灰霉病菌的培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的配制 將腐霉利原藥用丙酮溶解，配制成10 000 mg·L-1的母液，而后逐級(jí)稀釋，按一定比例加到滅菌后的培養(yǎng)基中，制成所需濃度的含藥培養(yǎng)基。

1.2.2 番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的敏感性測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定115株番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的敏感性：設(shè)置6個(gè)濃度梯度，以不添加腐霉利原藥為空白對(duì)照，將培養(yǎng)后的各菌株取直徑5 mm菌餅接種于含藥培養(yǎng)基平板中央，每處理3次重復(fù)，在25 ℃下黑暗培養(yǎng)72 h。測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，并利用SPSS軟件計(jì)算有效抑制中濃度（EC50值）、95%置信限、毒力回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R）。

1.2.3 番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利抗性指數(shù)的測(cè)定及其抗性水平的劃分 依據(jù)宋晰等（2013）測(cè)定的番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的敏感基線值（0.31 mg·L-1），對(duì)115株番茄灰霉病菌進(jìn)行抗性指數(shù)的測(cè)定和抗藥性水平的判別?？剐运脚袆e依據(jù)：當(dāng)抗性指數(shù)（RF）≤5，即菌株的EC50≤1.55 mg·L-1為敏感菌株；當(dāng)5＜RF≤10，即1.55 mg·L-1＜EC50≤3.10 mg·L-1為低抗菌株；當(dāng)10＜RF≤40，即3.10 mg·L-1＜EC50≤ 12.40 mg·L-1為中抗菌株；當(dāng)RF＞40，即EC50＞12.40 mg·L-1為高抗菌株。計(jì)算統(tǒng)計(jì)各地區(qū)番茄灰霉病菌的抗性頻率。

1.2.4 番茄灰霉病菌的DNA提取及PCR反應(yīng)體系

選取低抗菌株LNFK-1、LNHLD-16，中抗菌株LNSY-1、LNCY-8、LNDD-11、LNPLD-16以及高抗菌株LNPJ-11、LNFX-6作為研究對(duì)象。接種菌餅于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，22 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d后去除菌餅，用去離子水沖洗、過濾菌絲，重復(fù)沖洗3次，真空抽濾15 min，35 ℃下烘干1 d。將菌絲研磨成粉末。取10 mg菌絲粉采用Omega真菌基因組DNA抽提試劑盒（D3390-01，Omega Bio-tek，美國(guó)）進(jìn)行DNA的提取，并用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)DNA的濃度和純度。而后根據(jù)NCBI的GenBank登記的番茄灰霉病菌（BcOS1）基因序列（AF396827.2），利用Primer premier 5和Oligo 6.0程序設(shè)計(jì)4對(duì)引物（表1），包含了已經(jīng)在其他植物中報(bào)道的2個(gè)BcOS1基因位點(diǎn)。并用梯度PCR儀確定每對(duì)引物的最佳退火溫度。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 擴(kuò)增番茄灰霉病菌的引物序列

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（25 mmol·L-1）2.5 μL，hk1F（20 ng·μL-1）2.0 μL，hk1R（20 ng·μL-1）2.0 μL，TaqDNA Polymerase（2 U·μL-1）1.0 μL，DNA Template 1.0 μL以及ddH2O 14.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，在每個(gè)引物的最佳退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸2 min，共34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取8 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增效果。若擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，則擴(kuò)大PCR反應(yīng)體系至50 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，切下目的基因片斷膠，稱量回收膠，用膠回收試劑盒〔Takara Agarose Gel DNA Purification Kit，Ver.2.0，寶生物工程（大連）有限公司〕回收。

1.2.5 測(cè)序及序列分析 序列測(cè)定采用美國(guó)ABI公司的3730XL測(cè)序儀和雙脫氧鏈終止法進(jìn)行，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測(cè)序。對(duì)8個(gè)目標(biāo)菌株進(jìn)行突變檢測(cè)。將序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，然后用DNAMAN 8.0軟件對(duì)抗藥性和敏感性番茄灰霉病BcOS1基因片段序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 遼寧省番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的敏感性及抗性指數(shù)測(cè)定

從表2可以看出，遼寧省8個(gè)地區(qū)番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的EC50值平均為3.99 mg·L-1。在所測(cè)菌株中，最高EC50值為16.30 mg·L-1，抗性指數(shù)為52.58，已達(dá)高抗水平，是最低EC50值0.05 mg·L-1的326倍?？剐灾笖?shù)分布在0.16～52.58之間，平均抗性指數(shù)為12.87。

表2 遼寧省番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的敏感性

續(xù)表

2.2 遼寧省番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性水平、頻率及分布

從表3可以看出，在115株番茄灰霉病菌菌株中，敏感菌株19株，抗性菌株96株，抗性頻率83.48%。其中低抗菌株為31株，中抗菌株為63株，高抗菌株僅有2株?？梢姡锌咕暾急茸畲?，為65.62%。

遼寧省不同地區(qū)番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性存在差異（表3），其中5個(gè)地區(qū)的番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性頻率超過了80%。沈陽(yáng)地區(qū)的抗性問題最為嚴(yán)重，抗性頻率高達(dá)100.00%；而法庫(kù)地區(qū)的抗性頻率最低，僅為53.33%，在所檢測(cè)到的8株抗性菌株中，有7株為低抗菌株，僅有1株為中抗菌株。大部分地區(qū)的抗性菌株都以中抗菌株為主，僅在盤錦和阜新所采集的番茄灰霉病菌菌株中各檢測(cè)到1株高抗菌株。

2.3 番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性分子機(jī)制

用4對(duì)引物擴(kuò)增番茄灰霉病菌不同種群基因組DNA，分別得到大約1 719、972、707、1 630 bp的4個(gè)片段（圖1）。隨后進(jìn)一步測(cè)定了8個(gè)抗性菌株的基因序列，在NCBI中與已經(jīng)登記的番茄灰霉病菌灰葡萄孢組氨酸激酶基因（BcOS1）進(jìn)行BLAST比對(duì)，其序列同源性達(dá)到98%，證實(shí)這段序列正是BcOS1序列。根據(jù)已報(bào)道的BcOS1基因序列設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，8個(gè)腐霉利抗性菌株組氨酸激酶基因序列全長(zhǎng)為5 675 bp，編碼1 315個(gè)氨基酸。其中保守區(qū)域有2 180 bp，編碼619個(gè)氨基酸；非保守區(qū)域有3 495 bp，編碼696個(gè)氨基酸。對(duì)灰葡萄孢野生敏感菌株和野生抗二甲酰亞胺類藥劑菌株的雙組分組氨酸激酶基因（BcOS1）進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)（圖2），在測(cè)定的所有樣本中，第369位氨基酸都由谷氨酰胺突變成脯氨酸，第373位氨基酸由天冬酰胺突變成絲氨酸，所選抗性菌株的BcOS1基因均發(fā)生了雙位點(diǎn)突變。

表3 遼寧省番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗性及抗性頻率

圖1 番茄灰霉病抗腐霉利菌株BcOS1基因擴(kuò)增結(jié)果

圖2 抗藥種群番茄灰霉病菌BcOS1基因片斷及其氨基酸殘基的比對(duì)

3 結(jié)論與討論

番茄灰霉病菌一直是番茄生產(chǎn)中需要重點(diǎn)防治的高風(fēng)險(xiǎn)病菌，病害的發(fā)生也往往會(huì)對(duì)種植者造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。特別是隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，溫室環(huán)境更有利于病菌的滋生，為病害的發(fā)生提供了有利條件，近幾年番茄灰霉病也呈現(xiàn)出加重的趨勢(shì)（姚士桐 等，2011）。當(dāng)前，番茄灰霉病的防治主要還是依靠化學(xué)防治，特別是當(dāng)病害大面積暴發(fā)時(shí)，化學(xué)藥劑依然是應(yīng)對(duì)問題的首選（趙楊 等，2014）。但由于灰霉病菌變異快、產(chǎn)孢量大、易傳播等特點(diǎn)，對(duì)各類防治藥劑較易產(chǎn)生抗藥性，且目前以腐霉利、嘧霉胺為代表的防治番茄灰霉病的主要藥劑使用年限都已較長(zhǎng)，抗藥性問題也較為普遍，在實(shí)際應(yīng)用中就會(huì)存在種植者肆意加大用藥量，濫用藥劑的情況（喬廣行 等，2013）。所以在當(dāng)前形勢(shì)下，為應(yīng)對(duì)國(guó)家農(nóng)藥減施的要求，明確番茄灰霉病菌的抗藥性現(xiàn)狀，對(duì)指導(dǎo)農(nóng)民合理施藥，制定病害的防治措施都有重要意義。

本試驗(yàn)測(cè)定了2017年采自遼寧省沈陽(yáng)、普蘭店、盤錦、葫蘆島、朝陽(yáng)、丹東、法庫(kù)、阜新等8個(gè)地區(qū)的115株灰霉病菌菌株對(duì)腐霉利的敏感性，依據(jù)宋晰等（2013）建立的番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的敏感基線，明確了遼寧省番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性現(xiàn)狀，統(tǒng)計(jì)分析了其抗性頻率及分布。結(jié)果表明，遼寧省番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗性頻率高達(dá)83.48%，抗藥性已十分普遍。在前人的研究中，遼寧省灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗性頻率低，且多以低抗菌株為主（張傳清 等，2006；劉妍，2015），本試驗(yàn)結(jié)果表明，遼寧省番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性呈現(xiàn)加重的趨勢(shì)，抗性菌株由以前的低抗菌株為主發(fā)展到現(xiàn)在中抗菌株占據(jù)主體地位，且在部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)了高抗菌株。而遼寧省不同地區(qū)番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性情況也存在差異，沈陽(yáng)地區(qū)的番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性最為普遍，抗性頻率達(dá)到了100%，而盤錦地區(qū)番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性則最為嚴(yán)重，其平均EC50值為6.18 mg·L-1，抗性指數(shù)平均值高達(dá)19.92。

目前，與灰霉病菌對(duì)二甲酰亞胺類抗藥性相關(guān)的BcOS1基因可在第365、368、369、373位4個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，已報(bào)道的突變類型有7種（詹家綏 等，2014；張?chǎng)魏婉R雪梅，2014），大多的抗性菌株只在1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，雙位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生突變 的較 少（Ma et al.，2007；Banno et al.，2008）。但在本試驗(yàn)中，對(duì)隨機(jī)選取的8個(gè)抗性菌株進(jìn)行分子檢測(cè)及基因序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有抗性菌株BcOS1基因的第369位和第373位氨基酸均同時(shí)發(fā)生突變，引起這一特征的原因尚不清楚，推測(cè)可能與地區(qū)環(huán)境和用藥特點(diǎn)有關(guān)。如果這一推論得到證實(shí)，能否在病原菌外部環(huán)境與其內(nèi)在基因突變之間建立某種直接的聯(lián)系，以便直接根據(jù)地區(qū)的具體狀況來(lái)推斷該地區(qū)病菌發(fā)生何種突變，但這種猜想的具體驗(yàn)證還尚待大量研究（Ma & Michailides，2005）。

綜上，在應(yīng)對(duì)番茄灰霉病時(shí)，遼寧省應(yīng)適當(dāng)限制腐霉利的應(yīng)用，以避免抗藥性的進(jìn)一步加重。而引進(jìn)新型殺菌劑與生物農(nóng)藥，輪換使用嘧菌酯、嘧霉胺等不同類別的化學(xué)藥劑進(jìn)行灰霉病防治，也有助于控制番茄灰霉病菌抗藥性的發(fā)展。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，則需要進(jìn)一步加強(qiáng)番茄灰霉病菌抗藥性的監(jiān)測(cè)和治理，開發(fā)灰霉病防治的綜合技術(shù)，擺脫該類病害防治對(duì)化學(xué)藥劑的過度依賴，從根源上解決抗藥性問題，響應(yīng)國(guó)家農(nóng)藥減施的發(fā)展要求，推動(dòng)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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