張虹 季有波(通訊作者) 孫曉琪 楊琪 冷雪

130031長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)部1

130041吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科醫(yī)學(xué)中心2

130021吉林大學(xué)第一醫(yī)院放射線科3

黃芪多糖(APS)是臨床抗腫瘤中藥黃芪的主要成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，APS在體外對胃癌、肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤有明顯的抑制作用[1-3]，而APS對乳腺癌細胞增殖能力影響及其機制的報告較少。

資料與方法

實驗材料：①細胞培養(yǎng)：人乳腺癌細胞系(MCF-7)，在含10%胎牛血清(BI)的DMEM培養(yǎng)基、37℃、5%CO2空氣及飽和濕度條件下培養(yǎng)。②分組：黃芪多糖試驗組：分為0.75、1.5、3 mg/mL濃度組。對照組：分為0.1 μmol/L阿霉素組(Dox)及空白對照組(加生理鹽水)。③試劑：黃芪多糖為天津賽諾制藥有限公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為ThermoFisher產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品；DMSO均為美國Amresco公司產(chǎn)品。

實驗方法：①平板克隆形成試驗檢測細胞的增殖：將細胞以3×102個/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后，試驗組加入含0.75、1.5、3 mg/mL黃芪多糖的培養(yǎng)液，對照組僅加培養(yǎng)液。每組各設(shè)4個平行孔，每孔內(nèi)液體終體積為500 μL。置于37℃、5%CO2的孵箱中孵育10 d。棄去培養(yǎng)液，用PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)小心浸洗2次。加甲醇300 μL室溫固定15 min，棄去固定液，用姬姆薩染液染色20 min，用流水緩慢洗去染色液，置于空氣中干燥后計數(shù)。②MTT法檢測細胞的存活率：將細胞以3×103個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，試驗組加入含0.75、1.5、3 mg/mL的黃芪多糖的培養(yǎng)液，對照組僅為培養(yǎng)液。每組各設(shè)4個平行孔，每孔內(nèi)液體終體積100 μL。培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入10 μL新配制的5 mg/mL MTT溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清加入100 μL DMSO溶解，混勻后用酶標(biāo)儀，在570 nm波長測定吸收值(OD值)。腫瘤細胞存活率(%)=試驗組OD值/對照組OD值×100%。③流式細胞術(shù)檢測細胞周期：按照常規(guī)方法用PI染色，流式細胞儀檢測細胞周期。收集不同劑量黃芪多糖作用48 h后的MCF-7細胞，70%冷乙醇固定過夜。用PBS沖洗2次，加100 μg/mL RNase，37 ℃水浴30 min降解RNA，再用PBS洗2次后，加50 μg/mL PI染液，4℃避光反應(yīng)30 min。用FACSCalibur流式細胞儀Cell Quest軟件收取細胞(每個樣品收集1×104個細胞)，Modifit軟件分析細胞中DNA含量的變化。

統(tǒng)計學(xué)方法：使用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以(±s)表示，兩組獨立樣本的均數(shù)比較采用t檢驗；多組樣本均數(shù)采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；多時間點重復(fù)測量的資料采用重復(fù)測量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

平板克隆形成試驗檢測結(jié)果：不同藥物濃度的黃芪多糖作用于MCF-7后的細胞克隆數(shù)組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.063 9，P=0.000)，由此可見不同劑量組黃芪多糖對MCF-7細胞均有明顯的抑制作用，其中3.00 mg/mL濃度的黃芪多糖對MCF-7細胞增殖的抑制作用最明顯，見表1。

表1 黃芪多糖對MCF-7細胞增殖的抑制作用

黃芪多糖與細胞增殖的量效關(guān)系：MTT法檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)72 h后，隨黃芪多糖濃度的增大MCF-7細胞的存活率出現(xiàn)明顯降低，其中3.00 mg/mL濃度的黃芪多糖對MCF-7細胞的存活率影響最大，見圖1。

圖1 黃芪多糖抑制MCF-7細胞的量效變化

3 mg/mL的黃芪多糖抑制MCF-7細胞增殖的時程變化：3 mg/mL的黃芪多糖作用于MCF-7細胞后，細胞存活率在24、48、72 h分別為83%、51%、16%。APS組細胞存活率隨時間顯著減少(F=1 471.750，P=0.000)，對照組存活率隨時間變化不顯著(F=0.011，P=0.923)，時間和分組之間存在交互效應(yīng)(F=26.303，P=0.007)，兩組細胞存活率之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=354.357，P=0.000)。結(jié)果顯示3 mg/mL的黃芪多糖對MCF-7細胞的抑制作用隨時間延長而增強，見圖2。

圖2 黃芪多糖抑制MCF-7細胞的時程變化

黃芪多糖對MCF-7細胞周期的影響：黃芪多糖作用后，S期細胞比例減少，而G0/G1期細胞比例增加，見圖3。

圖3 黃芪多糖對MCF-7細胞周期的影響

討 論

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，我國每年新增乳腺癌患者約20萬[4]。得益于乳腺癌診斷技術(shù)的進步和新治療策略的普及，越來越多的患者得以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，該病死亡率有了顯著的下降[5]，但是同其他惡性腫瘤一樣，輔助化療帶來的不良反應(yīng)仍是困擾醫(yī)生和患者的重要問題，對改善乳腺癌患者治療后的生活質(zhì)量依然十分關(guān)鍵[6]。

黃芪是一味常見的中藥，是補虛中藥的代表，具有扶正固本、補中益氣的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，黃芪可以增強機體免疫力、減輕化療的不良反應(yīng)、顯著提高患者的生存質(zhì)量[7]。近年來腫瘤生物免疫治療研究逐漸深入，國內(nèi)外學(xué)者均認(rèn)為在腫瘤放化療及手術(shù)治療的同時，應(yīng)同時采取措施增強患者的免疫功能，降低化療對各器官的損傷，從而提高患者的生存質(zhì)量[8]。方曉松等使用黃芪多糖注射液聯(lián)合一般化療治療中晚期原發(fā)性肝癌[9]，結(jié)果顯示，APS可以提高患者的免疫功能、降低主要臟器的損傷，并且聯(lián)合治療組的腫瘤控制效果顯著優(yōu)于普通化療組，具有良好的應(yīng)用前景。

趙蓮華等體外研究指出[10]，APS可抑制肝癌Bel-7404細胞系的增殖，并且與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可加強對腫瘤細胞的殺傷作用。本研究得到類似結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其對MCF-7細胞具有生長抑制作用，但效果不及阿霉素，其濃度、作用時間均與抑制作用呈正相關(guān)。然而，許杜娟等研究發(fā)現(xiàn)[11]，APS在體外對腫瘤細胞沒有生長抑制效果，但在小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)基中加入APS培養(yǎng)48 h后，其上清可顯著抑制腫瘤細胞的生長；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，加入APS的小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IFN-γ的濃度顯著增加。因此，有學(xué)者認(rèn)為APS不是直接發(fā)揮抗腫瘤作用的，而是通過上調(diào)表達TNF-α和IFN-γ等免疫因子，增強機體的抗腫瘤免疫功能實現(xiàn)的。筆者認(rèn)為，體外試驗不能完全代替體內(nèi)情況，但APS在腫瘤端粒酶活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期以及上調(diào)TNF-α和IFN-γ的表達等方面對繼續(xù)深入研究有一定的啟示[12]。

細胞周期失控是惡性腫瘤的主要特征之一[13]，細胞在增殖、分化和凋亡方面的異常都參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，基于此，我們研究了黃芪多糖對腫瘤細胞周期的影響。結(jié)果顯示，黃芪多糖使S期細胞比例減少，而G0/G1期細胞比例增加。與巢蕾等在APS作用于胃癌細胞系MKN45的研究結(jié)果類似[14]。提示黃芪多糖抑制MCF-7細胞系增殖主要是依靠對腫瘤細胞由G1期進入S期的阻滯作用，使進入S期的細胞減少，從而延緩細胞周期進程，減慢細胞的增殖速率。

綜上所述，黃芪多糖對人乳腺癌細胞有顯著的生長抑制作用，這種作用隨藥物濃度和時間的增加而加強，誘導(dǎo)細胞周期阻滯于G0/G1期可能是其機制之一。

[1]黃惠風(fēng),錢建業(yè),謝少茹.黃芪多糖對人胃癌細胞MKN45誘導(dǎo)凋亡和細胞周期的影響[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2010,14(19):17-20.

[2]陳瑾歆,何軍,張娟娟,等.黃芪多糖對人肝癌細胞HepG2凋亡相關(guān)基因表達的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2014,34(1):124-126.

[3]王玉東.黃芪多糖對宮頸癌Hela細胞生長的抑制作用[D].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,2015.

[4]黃哲宙,陳萬青,吳春曉,等.中國女性乳腺癌的發(fā)病和死亡現(xiàn)況-全國32個腫瘤登記點2003-2007年資料分析報告[J].腫瘤,2012,32(6):435-439.

[5]中國進展期乳腺癌共識指南(CABC 2015)[J].癌癥進展,2015,13(3):223-245.

[6]中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2015版)[J].中國癌癥雜志,2015,25(9):692-754.

[7]田慶鍔,李煥德.黃芪多糖抗腫瘤作用研究進展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2011,17(12):86-88.

[8]葉媚娜,陳紅風(fēng),周瑞娟,等.黃芪多糖對基底細胞樣乳腺癌細胞增殖和Akt磷酸化的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2011,9(12):1339-1346.

[9]方曉松,周顰.注射用黃芪多糖治療原發(fā)性肝癌的療效觀察[J].重慶醫(yī)學(xué),2009,38(8):935-938.

[10]趙蓮華,李清,林梵,等.黃芪多糖協(xié)同順鉑對Bel-7404人肝癌細胞的殺傷作用[J].實用癌癥雜志,2005,20(1):34-35.

[11]許杜娟,陳敏珠.黃芪多糖的抑瘤作用及其機制[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜,2005,25(10):923-925.

[12]李志琴,章靜波.細胞周期調(diào)控與腫瘤[J].癌癥進展,2004,2(2):146-150.

[13]詹啟敏,陳杰.細胞周期與腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)[J].中國腫瘤臨床,2014,41(1):1-7.

[14]巢蕾,周杰,朱萱萱,等.黃芪多糖對人胃癌細胞系MKN45的生長抑制作用及細胞周期的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(11):2474-2477.