130021長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是一種常見的呼吸疾病，表現(xiàn)為睡眠過程中反復(fù)發(fā)生上氣道阻塞，導(dǎo)致通氣降低或停止，同時(shí)可伴有低氧血癥[1]。OSAHS患者可出現(xiàn)白天困倦、乏力、注意力不集中、頭暈、胸悶、心慌、性功能減退等多臟器、多系統(tǒng)功能損害，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2-6]。本課題組以“調(diào)宗氣”理論為基礎(chǔ)運(yùn)用自主設(shè)計(jì)的湯方、外用塌漬、針灸治療OSAHS，已取得了成效。上氣道擴(kuò)張肌活性異常在OSAHS發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，而頦舌肌為上氣道最主要擴(kuò)張肌，經(jīng)臨床和基礎(chǔ)研究證實(shí)，其功能異?？蓪?dǎo)致上氣道閉陷而引發(fā)疾病。因此，本研究擬通過“調(diào)宗氣”理論指導(dǎo)下組方對(duì)慢性間歇性缺氧大鼠頦舌肌鈣離子濃度影響的研究，找到“調(diào)宗氣”法有效治療OSAHS的作用機(jī)理，為尋找更加有效的治療方法提供科學(xué)依據(jù)，將“調(diào)宗氣”這一獨(dú)特中醫(yī)理論充分運(yùn)用并有效指導(dǎo)臨床治療。

資料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)選取健康Wistar大鼠，雄性，體重220～250 g，10只；體重350～400 g，50只，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(遼)2015-0001。在長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為室溫18～22℃，濕度50%～70%，自然光照，大鼠正常飼養(yǎng)，每5只一籠，自由飲食。

藥品與試劑：調(diào)宗氣湯方藥物組成：黃芪，黨參，陳皮，法半夏，茯苓，白術(shù)，炙甘草，蘇子，萊菔子，地龍等。購(gòu)自于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院免煎室，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心制作。

Ca離子濃度比色法定量檢測(cè)試劑盒：規(guī)格為96T，美國(guó)GENMEDSCIENTIFICS INC產(chǎn)品，批號(hào)為20160601。

實(shí)驗(yàn)氣體：醫(yī)用氧氣與高純度氮?dú)猓瑵舛龋?9.99%，由長(zhǎng)春市醫(yī)巨洋氣體提供。

實(shí)驗(yàn)儀器：低氧動(dòng)物艙由本實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合長(zhǎng)春市雨潤(rùn)農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司制作；大鼠轉(zhuǎn)棒疲勞儀型號(hào)為ZH-YLS-4C，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電子天平型號(hào)為YP1201N，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；可調(diào)高速勻漿器為FSH-2A型，江蘇省金壇縣望華科較儀器廠產(chǎn)品；賀利氏(Heraeus)臺(tái)式離心機(jī)Stratos型號(hào)Biofuge Stratos，德國(guó)賀利氏公司產(chǎn)品；紫外/可見分光光度計(jì)型號(hào)為L(zhǎng)ambda25，美國(guó)Perkin Elmer公司產(chǎn)品。

實(shí)驗(yàn)方法：①中藥的制作：調(diào)宗氣湯方藥物組成：黃芪，黨參，陳皮，法半夏，茯苓，白術(shù)，炙甘草，蘇子，萊菔子，地龍等。將上述中藥免煎提取物溶于83 mL的蒸餾水中備用。②實(shí)驗(yàn)分組及給藥處理方法：實(shí)驗(yàn)選取清潔級(jí)健康Wistar大鼠，雄性，體重220～250 g，10只，作為青年鼠對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)選取清潔級(jí)健康Wistar大鼠，雄性，體重350～400 g，50只，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只動(dòng)物，分別為老年鼠對(duì)照組、老年鼠模型組、中藥組、中藥+運(yùn)動(dòng)組、中藥+運(yùn)動(dòng)+吸氧組。青年鼠對(duì)照組、老年鼠對(duì)照組、老年鼠模型組動(dòng)物給予1 mL/kg·d蒸餾水灌胃；中藥組動(dòng)物給予23.33 g/kg·d中藥灌胃，該給藥劑量約為該藥物臨床每天使用等效劑量的2倍；中藥+運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物給予23.33 g/kg·d中藥灌胃后，強(qiáng)迫其于大鼠轉(zhuǎn)棒疲勞儀中運(yùn)動(dòng)30 min/d；中藥+運(yùn)動(dòng)+吸氧組動(dòng)物給予23.33 g/kg·d中藥灌胃，強(qiáng)迫其于大鼠轉(zhuǎn)棒疲勞儀中運(yùn)動(dòng)30 min/d后，置于低氧動(dòng)物艙吸純氧氣30 min/d。

慢性間歇性缺氧模型的建立(參照袁氏和Fletcher方法并改進(jìn)[7])：①低氧動(dòng)物艙的建立：用7 mm厚有機(jī)玻璃制成長(zhǎng)方體艙，規(guī)格120 cm×60 cm×60 cm，上配可打開密封蓋，用于取放動(dòng)物，側(cè)壁留一個(gè)小孔，直徑20 mm，用作輸入濃度99%氮?dú)?，兩端分別安裝直徑160 mm的電動(dòng)風(fēng)閥各1個(gè)，其中一端安裝風(fēng)機(jī)，用于缺氧艙內(nèi)氣體排出及空氣吸入。試驗(yàn)過程中將艙內(nèi)水蒸氣和二氧化碳分別用硅膠干燥劑和生石灰吸收。②氣體控制通路：設(shè)計(jì)由單片機(jī)程序控制定時(shí)電磁轉(zhuǎn)換器、電動(dòng)風(fēng)閥及風(fēng)機(jī)開關(guān)，控制氮?dú)廨斎牒涂諝馕?，每個(gè)循環(huán)過程120 s，即充入60 s氮?dú)猓S后利用風(fēng)機(jī)與電動(dòng)風(fēng)閥將艙內(nèi)氣體排出并吸入60 s空氣。③慢性間歇性缺氧實(shí)驗(yàn)：將老年鼠模型組、中藥組、中藥+運(yùn)動(dòng)組、中藥+運(yùn)動(dòng)+吸氧組大鼠分別置于慢性間歇性低氧艙內(nèi)，緊閉艙門，循環(huán)充入氮?dú)夂蛪嚎s空氣。該循環(huán)每天重復(fù)8 h(8:30-16:30)，共持續(xù)5周。采用數(shù)字式測(cè)氧儀持續(xù)檢測(cè)慢性間歇性缺氧艙內(nèi)FiO2，及時(shí)調(diào)節(jié)氣體流量，使每一循環(huán)過程中艙內(nèi)最低FiO2達(dá)到5%～6%，隨后逐漸恢復(fù)至21%，以使大鼠平均動(dòng)脈最低血氧飽和度在0.60～0.80。青年鼠對(duì)照組、老年鼠對(duì)照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何處理。數(shù)字式測(cè)氧儀檢測(cè)結(jié)果為艙內(nèi)FiO2在輸入氮?dú)夂笾饾u減低至5%～6%，持續(xù)約6～10 s，隨著壓縮空氣輸入，F(xiàn)iO2逐漸升至20%～21%。各組動(dòng)物于造模當(dāng)日起每日灌胃及處理1次，連續(xù)5周。

檢測(cè)指標(biāo)：于5周末給藥30 min后，各組動(dòng)物經(jīng)20%烏來糖溶液(5 mL/kg)麻醉后處死。剖取大鼠頦舌肌組織，按每克頦舌肌組織加9 mL生理鹽水，制成10%組織勻漿，3 000 rpm離心10 min，取上清勻漿液。嚴(yán)格按照鈣離子濃度比色法定量檢測(cè)試劑盒試劑說明書操作，采用比色法定量檢測(cè)其頦舌肌組織中鈣離子含量。準(zhǔn)備5個(gè)1.5 mL的離心管，用緩沖液及標(biāo)準(zhǔn)液分別配制好0、0.5、1、2、4 mmol標(biāo)準(zhǔn)鈣濃度，用以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取出比色杯，加入20 μL的緩沖液與20 μL的反應(yīng)液，然后加入20 μL的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)勻漿液，混勻后，室溫避光溫育5 min，于570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)其OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中鈣離子含量。

結(jié) 果

“調(diào)宗氣”組方對(duì)慢性間歇性低氧老年大鼠頦舌肌鈣離子濃度的影響：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，老年鼠對(duì)照組動(dòng)物與青年鼠對(duì)照組比較，頦舌肌鈣離子濃度極顯著性降低(P＜0.001)，證明隨著年齡的增長(zhǎng)，頦舌肌逐漸松弛無力，與其中鈣離子濃度降低有關(guān)。老年鼠模型組動(dòng)物與老年鼠對(duì)照組比較，頦舌肌鈣離子濃度極顯著性降低(P＜0.001)，證明間歇性缺氧會(huì)造成動(dòng)物頦舌肌中鈣離子降低，導(dǎo)致頦舌肌松弛，模型復(fù)制成功。

中藥組動(dòng)物頦舌肌鈣離子濃度與老年鼠模型組比較顯著性增加(P＜0.05)，中藥+運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物頦舌肌鈣離子濃度與老年鼠模型組比較極顯著性增加(P＜0.01)，中藥+運(yùn)動(dòng)+吸氧組動(dòng)物頦舌肌鈣離子濃度與老年鼠模型組比較極顯著性增加(P＜0.001)，證明中藥、運(yùn)動(dòng)、吸氧對(duì)間歇性低氧模型動(dòng)物頦舌肌鈣離子濃度均有改善作用，并以聯(lián)合應(yīng)用的效果最為明顯，見表1。

表1 “調(diào)宗氣”組方對(duì)慢性間歇性低氧老年大鼠頦舌肌鈣離子濃度的影響(±s)

表1 “調(diào)宗氣”組方對(duì)慢性間歇性低氧老年大鼠頦舌肌鈣離子濃度的影響(±s)

注：與老年鼠模型組比較，?P＜0.05， ??P＜0.01，???P＜0.001。

討 論

目前已證實(shí)許多危險(xiǎn)因素參與OSAHS的發(fā)病和進(jìn)展，其中以頦舌肌為主的上氣道擴(kuò)張肌結(jié)構(gòu)和功能障礙被認(rèn)為是OSAHS的主要致病因素之一。擴(kuò)張肌中的頦舌肌是上氣道中最大也是最主要的擴(kuò)張肌，被稱為上氣道的“安全肌”。清醒狀態(tài)下，OSAHS患者頦舌肌的活動(dòng)達(dá)到其最大活動(dòng)能力的40%，遠(yuǎn)較正常人12%的水平高，提示為了維持上氣道開放，其上氣道肌肉活動(dòng)代償性增強(qiáng)[8]?？梢约僭O(shè)，如果沒有代償性活動(dòng)，清醒時(shí)即有可能出現(xiàn)上氣道阻力明顯增高，甚至發(fā)生呼吸暫停。在睡眠時(shí)，阻塞性睡眠呼吸暫?；颊呱蠚獾兰∪饣顒?dòng)變化明顯不同于正常人，睡眠開始，可見頦舌肌的吸氣時(shí)相性活動(dòng)減弱，其他擴(kuò)張肌張力性活動(dòng)也降低，對(duì)吸氣負(fù)壓增加的反射性代償活動(dòng)消失，不能對(duì)抗胸腹部呼吸肌產(chǎn)生的吸氣負(fù)壓而發(fā)生OSAHS[9-13]。Pierce等的研究發(fā)現(xiàn)OSAHS患者上氣道陷閉以及氣流阻力的增加與頦舌肌功能障礙密切相關(guān)[14]。

胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度直接影響骨骼肌收縮和松弛，進(jìn)而引起咽部肌肉組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致阻塞程度的加重或減輕。人體的多種運(yùn)動(dòng)都是由骨骼肌的收縮功能實(shí)現(xiàn)的，骨骼肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)機(jī)制是骨骼肌收縮的基礎(chǔ)。胞質(zhì)鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)廣泛的第二信使，在肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)過程中發(fā)揮重要作用。

本課題研究結(jié)果表明了“調(diào)宗氣”組方對(duì)大鼠頦舌肌成肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度有著顯著的影響，在維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用，其維持肌細(xì)胞活性，從而減少肌肉的疲勞松弛與損傷。

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