禹名卉 王福利 李天然

·基礎(chǔ)研究·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞的影響*

禹名卉① 王福利② 李天然③

目的：觀察人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）對(duì)植入低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞動(dòng)物模型生長(zhǎng)的影響情況以及對(duì)轉(zhuǎn)移潛能和凋亡趨勢(shì)的影響。方法：制作人低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-L動(dòng)物模型，將動(dòng)物隨機(jī)分為模型實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組在接種腫瘤后第7 d開(kāi)始尾靜脈注射BMSCs 5×105/只，模型對(duì)照組相同時(shí)間尾靜脈注射BMSCs培養(yǎng)液0.2 mL/只。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每周用卡尺測(cè)一次皮下腫瘤體積，分別于腫瘤接種后第14d（2周）、21 d（3周）、28 d（4周）、35 d（5周）、42 d（6周）處死動(dòng)物，完整剖取瘤塊并稱瘤重和體積，計(jì)算腫瘤抑制率。Real-time PCR法檢測(cè)低轉(zhuǎn)移肝癌動(dòng)物模型標(biāo)本中轉(zhuǎn)移相關(guān)因子骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨唾液蛋白（bone salivary protein，BSP）、整合素（integrinαⅤ）基因以及凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、caspase3基因的表達(dá)。結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤重量和體積的抑制作用在第3周具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量顯著低于對(duì)照組。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤的抑制作用在第2、3、5、6周均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積顯著低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)均低于對(duì)照組，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)后腫瘤促凋亡因子Bax、caspase3的表達(dá)呈升高趨勢(shì)，抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)逐漸下降。結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-L的生長(zhǎng)具有抑制作用，且第3周時(shí)抑制效果最好，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤抑制率逐漸下降。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 肝細(xì)胞癌 動(dòng)物模型 轉(zhuǎn)移 凋亡

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率有上升趨勢(shì)［1］。HCC逐漸從肝硬化發(fā)展為肝衰竭，最終導(dǎo)致全身侵襲和轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除仍是目前最有效的治療手段［23］。肝移植由于其昂貴的治療成本以及供體器官的缺乏通常使該方法難以實(shí)施。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓衍生的非造血基質(zhì)細(xì)胞［3］，是具有增殖能力和分化潛能的干細(xì)胞，能夠分化成多種類型的細(xì)胞，可以產(chǎn)生肝細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞。BMSCs容易獲得，具有體外增殖的潛力并且不易丟失［4］。有研究表明BMSCs可以分泌一些肝細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子促進(jìn)肝細(xì)胞增殖［5］，包括人類生長(zhǎng)因子HGF，血管生成因子VEGF，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF和許多白細(xì)胞介素。自體骨髓干細(xì)胞移植已被用于治療失代償性肝硬化，表明干細(xì)胞移植是一種新穎、安全有效的方法［3］。本實(shí)驗(yàn)的前期研究中同時(shí)采用高、低轉(zhuǎn)移潛能肝細(xì)胞癌小鼠模型進(jìn)行研究，研究結(jié)果顯示低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞在BMSCs干預(yù)后OPN、β3、TGFβ1、αv表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）［6］。本文著重闡述BMSCs對(duì)低轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞癌的作用，以期彌補(bǔ)低轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞癌研究方面的空缺，為清楚闡明其作用機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 60只健康Balb/c裸鼠，體質(zhì)量14～17 g，6周齡，雌雄各半，SPF級(jí)，由中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（京）2009-0017。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞株 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，由廣州賽業(yè)科技有限公司提供。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，BMSCs細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD105抗原均大于70%，表達(dá)CD45、CD14抗原均小于5%；進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，分別經(jīng)油紅O染色、茜素紅染色、阿利新藍(lán)染色呈陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果合格，符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。人低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞（MHCC97-L），由上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所提供。

1.1.3 試劑 無(wú)菌0.9%氯化鈉注射液，由北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；無(wú)水乙醇（Ethyl alcohol，absolute A.R.），由北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.1.4 儀器及設(shè)備 一次性使用注射器（美國(guó)BD公司）、奧豪斯電子精密天平（U.S.A OHAUS coep）、電子數(shù)顯卡尺（桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司）、日本NIKON倒置顯微鏡、Olympus/PM-6顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理方法 取經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)已在裸鼠體內(nèi)皮下接種生長(zhǎng)良好的MHCC97-L腫瘤結(jié)節(jié)，無(wú)菌操作制成瘤細(xì)胞小塊，用穿刺針接種于裸鼠腋窩皮下。將動(dòng)物隨機(jī)分為模型對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組30只，稱體重標(biāo)號(hào)。實(shí)驗(yàn)組在接種腫瘤后第7 d開(kāi)始尾靜脈注射BMSCs（5×105/只）。模型對(duì)照組相同時(shí)間尾靜脈注射BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)液0.2 mL/只。裸鼠飼養(yǎng)在ⅣC-Ⅱ型（智能型）獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具屏蔽系統(tǒng)輔以潔凈層流柜的動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)，室溫20～22℃，相對(duì)濕度40%～60%。裸鼠食用滅菌裸鼠飼料（SPF級(jí)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所產(chǎn)品）。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每周用卡尺測(cè)一次皮下腫瘤體積，分別于腫瘤接種后第14 d（2周）、21 d（3周）、28 d（4周）、35 d（5周）、42 d（6周）處死動(dòng)物，完整剖取瘤塊并稱瘤重和體質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率。

1.2.2 Real-time PCR法檢測(cè)基因表達(dá) Real-time PCR法檢測(cè)低轉(zhuǎn)移肝癌動(dòng)物模型標(biāo)本中轉(zhuǎn)移相關(guān)因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ以及凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、caspase3的表達(dá)。提取腫瘤標(biāo)本RNA，進(jìn)行濃度和純度測(cè)定，符合要求后用RevertAid?M-MLV RT反應(yīng)系統(tǒng)和Oligo（dT）合成cDNA，經(jīng)特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增相應(yīng)的cDNA。PCR條件：預(yù)變性95℃、5 min；變性 94℃、30 s，退火 58℃、30 s，延伸72℃、30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃、10 min。PCR產(chǎn)物電泳并經(jīng)凝膠電泳處理系統(tǒng)掃描半定量分析。

1.2.3 Real-time PCR引物序列設(shè)計(jì) 引物序列來(lái)自Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)，由賽業(yè)（廣州）生物科技公司合成，以人肌動(dòng)蛋白β-Actin為內(nèi)參照物，引物序列如下（表1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson積矩相關(guān)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖中所有均數(shù)相關(guān)數(shù)據(jù)均采用標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行作圖。

藥效判定標(biāo)準(zhǔn)：

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組60只Balb/c裸鼠在造模過(guò)程中未出現(xiàn)死亡，數(shù)據(jù)記錄完整，均可用于結(jié)果分析。

2.1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤重量隨時(shí)間變化比較分析

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤重量均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組腫瘤在第2、3、4、5、6周分別為 0.05±0.01、0.12±0.05、0.27±0.05、0.57±0.22、0.79±0.12，對(duì)照組分別為0.07±0.05、0.21±0.01、0.39±0.15、0.87±0.32、1.12±0.23（g），實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量均低于對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤重量間的差異在第3周具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023），說(shuō)明BMSCs在MHCC97-L生長(zhǎng)的過(guò)程中表現(xiàn)出對(duì)其重量的抑制作用，并且抑制效果在第3周最為顯著。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.2 腫瘤重量抑制率

根據(jù)上述腫瘤抑制率計(jì)算公式分別求得2、3、4、5、6周腫瘤重量抑制率隨時(shí)間的變化情況，分別為28.57%、42.86%、30.77%、34.48%、29.46%。腫瘤重量抑制率在第3周達(dá)到峰值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤體積變化對(duì)比

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤體積均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積在第2、3、4、5、6周分別為134.37±33.17、224.00±27.34、359.52±71.96、457.07±59.87、695.68±72.99，對(duì)照組分別為 222.36±43.06、377.43±63.75、560.53±115.15、699.20±19.88、986.47±91.49（mm3），實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積始終小于對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤體積間的差異在第2、3、5、6周均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.049、0.019、0.003、0.014。結(jié)果表明BMSCs表現(xiàn)出抑制腫瘤體積增長(zhǎng)的作用，并且其抑制作用相對(duì)于重量抑制作用更為顯著，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。

2.4 腫瘤體積抑制率

腫瘤體積抑制率計(jì)算公式同上述腫瘤重量抑制率計(jì)算公式，分別求得2、3、4、5、6周腫瘤體積抑制率隨時(shí)間的變化情況，分別為39.57%、40.65%、35.86%、34.63%、29.48%，腫瘤體積抑制率在第3周達(dá)到峰值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.5 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，應(yīng)用BMSCs干預(yù)后，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ基因均為實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間OPN 表達(dá)差異第2、3、4、5、6周P值分別為 0.422、0.382、0.142、0.066、0.060；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間BSP表達(dá)差異第 2、3、4、5、6周 P 值分別為 0.725、0.592、0.754、0.095、0.498；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間IntegrinαⅤ表達(dá)差異第 2、3、4、5、6周P值分別為 0.251、0.422、0.111、0.037、0.182。

2.6 腫瘤凋亡相關(guān)因子

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，應(yīng)用BMSCs干預(yù)后，腫瘤促凋亡相關(guān)因子Bax表達(dá)量在第2、3、4、5、6周分別為1.01±0.14，1.42±0.15，1.79±0.19，2.31±0.24，3.16±0.26；caspase3表達(dá)量分別為1.01±0.14，1.91±0.13，2.84±0.30，3.42±0.36，4.38±0.41；腫瘤抗凋亡相關(guān)因子Bcl-2表達(dá)量分別為1.00±0.11，0.86±0.12，0.60±0.06，0.41±0.03，0.26±0.05。腫瘤促凋亡相關(guān)因子Bax、caspase3均呈升高趨勢(shì)，抗凋亡相關(guān)因子Bcl-2呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.7 BMSCs干預(yù)后MHCC97-L動(dòng)物模型腫瘤重量抑制率與轉(zhuǎn)移及凋亡因子相關(guān)性分析

腫瘤重量抑制率與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子OPN進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.664，r=-0.267；腫瘤重量抑制率與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子BSP進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.540，r=-0.370；腫瘤重量抑制率與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子IntegrinαⅤ進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.516，r=-0.390。腫瘤重量抑制率與促凋亡相關(guān)因子Bax進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.712，r=-0.228；腫瘤重量抑制率與促凋亡相關(guān)因子caspase3進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.771，r=-0.180；腫瘤重量抑制率與抗凋亡因子Bcl-2進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.703，r=0.235。相關(guān)分析顯示腫瘤重量抑制率與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子及凋亡相關(guān)因子無(wú)相關(guān)（P＞0.05，圖1，2）。

2.8 BMSCs干預(yù)后MHCC97-L動(dòng)物模型腫瘤體積抑制率與轉(zhuǎn)移及凋亡因子相關(guān)性分析

腫瘤體積抑制率與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子OPN進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.269，r=0.616；腫瘤體積抑制率與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子BSP進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.533，r=0.376；腫瘤體積抑制率與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子IntegrinαⅤ進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.575，r=0.340。腫瘤體積抑制率與促凋亡相關(guān)因子Bax進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.010，r=-0.958；腫瘤體積抑制率與促凋亡相關(guān)因子caspase3進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.020，r=-0.934；腫瘤體積抑制率與抗凋亡相關(guān)因子Bcl-2進(jìn)行相關(guān)分析得P=0.018，r=0.939。腫瘤體積抑制率與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ基因無(wú)相關(guān)（P＞0.05），與促凋亡相關(guān)因子Bax、caspase3及抗凋亡相關(guān)因子Bcl-2顯著相關(guān)（P＜0.05）（圖3，4）。

2.9 通過(guò)動(dòng)物模型熒光成像觀察BMSCs對(duì)MHCC97-L組織動(dòng)物模型的干預(yù)作用

裸鼠皮下移植瘤模型進(jìn)行熒光活體成像，預(yù)先打開(kāi)活體成像儀20 min，將CCD相機(jī)冷卻到-25℃以下。檢測(cè)前使用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉裸鼠，按照組別順序排列在活體成像儀拍攝倉(cāng)內(nèi)。使用激發(fā)光55 nm、發(fā)射光600 nm檢測(cè)，曝光時(shí)間為10 s。同時(shí)在無(wú)激發(fā)光、發(fā)射光條件下，0.17 s拍攝，保存明場(chǎng)圖像，熒光圖像采用軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。觀察BMSCs與肝癌組織細(xì)胞融合圖像發(fā)現(xiàn)BMSCs進(jìn)入腫瘤組織。圖中腫瘤組織細(xì)胞呈綠色，BMSCs細(xì)胞呈藍(lán)色（圖5）。

圖1 腫瘤重量抑制率與轉(zhuǎn)移因子相關(guān)性分析Figure 1 Correlation analysis of tumor weight inhibition rate and transfer factor

圖2 腫瘤重量抑制率與凋亡因子相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis of tumor weight inhibition rate and apoptosis factor

圖3 腫瘤體積抑制率與轉(zhuǎn)移因子相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis of tumor volume inhibition rate and transfer factor

圖4 腫瘤體積抑制率與凋亡因子相關(guān)性分析Figure 4 Correlation analysis of tumor volume inhibition rate and apoptosis factor

圖5 BMSCs對(duì)肝癌（MHCC97-H）干預(yù)情況的病理切片熒光成像（fluorescence staining×200）Figure 5 Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on liver cancer(MHCC97-L)detected by fluorescence imaging(GFP label the tumor cells in green color,Ex,488 nm;Em,543 nm;DAPI mark the BMSCs in blue,Ex,358 nm;Em,461nm)(×200)

3 討論

手術(shù)切除仍為HCC治療的首選方法，但經(jīng)手術(shù)切除治療后的患者仍具有較高的術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率［7］。開(kāi)辟新療法成為了肝癌研究領(lǐng)域的重要任務(wù)。1974年首次從骨髓中分離獲得BMSCs［8］，其具有對(duì)炎癥和腫瘤發(fā)生位點(diǎn)的趨向性［9］，容易在體外培養(yǎng)進(jìn)行繁殖并維持自我更新能力，集中向炎癥組織和重塑組織遷移，具有較低的免疫原性和抗感染特性［10］，有助于器官和組織的快速修復(fù)，抑制免疫反應(yīng)和抗肝纖維化。

BMSCs抑制MHCC97-L動(dòng)物模型腫瘤增長(zhǎng)的作用機(jī)制可能通過(guò)以下途徑進(jìn)行。OPN通過(guò)結(jié)合其受體整合素αvβ3促進(jìn)肝癌細(xì)胞株HepG膜型CD44v6表達(dá)，而CD44v6與透明質(zhì)酸結(jié)合促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移，BMSCs通過(guò)抑制OPN與IntegrinαⅤ的表達(dá)來(lái)阻止肝癌的增長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。Bax與Bcl-2基因是目前在凋亡調(diào)控中研究較多的基因，Bax基因?qū)儆贐cl-2家族成員之一，Bcl-2蛋白表達(dá)減少或Bax蛋白表達(dá)增加時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)增加或Bax蛋白表達(dá)減少時(shí)，則抑制細(xì)胞凋亡［11］。關(guān)于Bax/Bcl-2的具體作用機(jī)制目前尚未完全明確［12］，可能通過(guò)調(diào)節(jié)促凋亡因子細(xì)胞色素C從線粒體的釋放，進(jìn)而影響caspase 3的激活而發(fā)揮其作用。caspase 3是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，在細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中扮演了關(guān)鍵角色。研究發(fā)現(xiàn)，caspase 3是肝星形細(xì)胞凋亡的重要途徑之一［13］。caspase 3正常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，激活的cas?pase 3一方面通過(guò)水解特異性細(xì)胞蛋白直接導(dǎo)致凋亡，另一方面通過(guò)破壞DNA修復(fù)蛋白，如多聚ADP-核糖聚合酶，抑制DNA修復(fù)，協(xié)助凋亡的完成［14］。BMSCs通過(guò)增加Bax與caspase 3基因的表達(dá)，抑制Bcl-2基因的表達(dá)從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)BMSCs干預(yù)后轉(zhuǎn)移相關(guān)因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ基因的表達(dá)均低于干預(yù)前，促凋亡相關(guān)因子Bax和caspase 3呈增高趨勢(shì)，抗凋亡因子Bcl-2呈下降趨勢(shì)。相關(guān)性分析顯示腫瘤體積抑制率與凋亡相關(guān)因子顯著相關(guān)，表明腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中受凋亡因子影響明顯，BMSCs可以通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)以及增加促凋亡相關(guān)因子，減少抗凋亡相關(guān)因子的表達(dá)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

研究發(fā)現(xiàn)BMSCs能夠抑制肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)肝纖維化［15］，證實(shí)其具有修復(fù)受損肝組織的功能［16］。Abdelaziz等［17］發(fā)現(xiàn)BMSCs可以增加肝癌細(xì)胞的凋亡率。BMSCs可以減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的表達(dá)從而達(dá)到抑制肝臟纖維化的作用。BMSCs已被認(rèn)為是治療和預(yù)防HCC的分子療法的特定靶標(biāo)［18］。但也有研究已經(jīng)證明BMSCs有助于乳腺癌和前列腺癌腫瘤干細(xì)胞的發(fā)展［19］。有研究表明BMSCs分泌白介素IL-6會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，IL-6是一種促炎細(xì)胞因子，報(bào)道顯示其能夠促進(jìn)HCC［20］、胃癌［21］、乳腺癌［22］及肺癌［23］的轉(zhuǎn)移，但目前IL-6對(duì)BMSCs影響的作用機(jī)制及作用效果尚待研究。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠尾靜脈注射的方法證實(shí)了BM?SCs對(duì)MHCC97-L的生長(zhǎng)確有抑制作用，為BMSCs在HCC治療中的應(yīng)用提供了新證據(jù)。為明確BMSCs的抑瘤作用，以及使用BMSCs后腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)質(zhì)性變化，尚需大量實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行證實(shí)。對(duì)于BMSCs的未來(lái)研究可以嘗試在小鼠原發(fā)性肝癌模型上進(jìn)行，其能否廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤的治療以及應(yīng)用效果如何有待于進(jìn)一步的研究。

[1]Zhang J,HouL,Wu X,et al.Inhibitory effect of genetically engineered mesenchymal stem cells with Apoptin on hepatoma cells in vitro and in vivo[J].Mol Cell Biochem,2016,416(1):193-203.

[2]Vainshtein JM,Kabarriti R,Mehta KJ,et al.Bone marrow-derived stromal cell therapy in cirrhosis:clinical evidence,cellularmechanisms,and implications for the treatment of hepatocellularcarcinoma[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2014,89(4):786-803.

[3]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymalstem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.

[4]Nussler A,Konig S,Ott M,et al.Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases[J].Hepatol,2006,45(1):144-159.

[5]Hang HL,Xia Q.Role of BMSCs in liver regeneration and metastasis after hepatectomy[J].World J Gastroenterol,2014,20(1):126-132.

[6]Li TR,Yu MH,Huang XB,et al.Magnetic resonance gd-rgd imaging study of hepatocellular carcinoma with high and low metastatic potential before and after human bone marrow-derived mesenchymal stem cell intervention[J].Chin Med J(Engl),2017,130(21):2591-2600.

[7]Wang X,Mei J,Liao C,et al.Relationship between mesenchymal stem cells and liver cancer recurrence after liver transplantation in mice[J].Nat Med J China,2014,94(6):455-463.

[8]Poon RT,Fan ST,Lo CM,et al.Improving perioperative outcome expands the role of hepatectomy in management of benign and malignant hepatobiliary diseases:analysis of 1222 consecutive patients from a prospective database[J].Ann Surg,2004,240(4):296-308.

[9]Bayo J,Marrodán M,AquinoJ B,et al.The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells on hepatocellular carcinoma[J].Liver Int,2014,34(3):330-342.

[10]Xie C,Xie DY,Lin BL,et al.Interferon-β gene-modified human bone marrow mesenchymal stem cells attenuate hepatocellular carcinoma through inhibiting AKT/FOXO3a pathway[J].Br J Cancer,2013,109(5):1198-1205.

[11]Khan N,Adhami VM,Afaq F,et al.Butein induces apoptosis and inhibits prostate tumor growth in vitro and in vivo[J].Antioxid Redox Signal,2012,16(11):1195-1204.

[12]Czabotar PE,Lessene G,Strasser A,et al.Control of apoptosis by the BCL-2 protein family:implications for physiology and therapy[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(1):49-63.

[13]Jamee lN,Thirunavukkarasu CT,Watkins S,et al.p38‐MAPK‐and caspase‐3‐mediated superoxide‐induced apoptosis of rat hepatic stellate cells:Reversal by retinoic acid[J].J Cell Physiol,2009,218(1):157-166.

[14]Snigdha S,Smith ED,Prieto GA,et al.Caspase-3 activation as a bifurcation point between plasticity and cell death[J].Neurosci Bull,2012,28(1):14-24.

[15]Mu XF,Gao PJ.Research progress of bone marrow mesenchymal stem cells in treatment of hepatocellular carcinoma[J].Chinese Journal of Geriatrics,2015,35(12):3472-3473.[穆雪峰,高普均.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝細(xì)胞癌的研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué),2015,35(12):3472-3473.]

[16]Petersen BE,Bowen WC,Patrene KD,et al.Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells[J].Science,1999,284(5417):1168-1170.

[17]Abdelaziz MT,ElAM F,Atta HM,et al.Efficacy of mesenchymal stem cells in suppression of hepatocarcinorigenesis in rats:possible role of Wnt signaling[J].J Exp Clin Cancer Res,2011,30(1):49-60.

[18]Gong P,Wang Y,Zhang J,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells in hepatocellular carcinoma[J].Front Biosci(Landmark Ed),2013,18(3):811-819.

[19]Luo J,Lee SO,Liang L,et al.Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling[J].Oncogene,2013,33(21):2768-2778.

[20]Mano Y,Aishima S,Fujita N,et al.Tumor-associated macrophage promotes tumor progression via STAT3 signaling in hepatocellular carcinoma[J].Pathobiology,2013,80(3):146-154.

[21]Wang Z,Siv X,Xuv A,et al.Activation of STAT3 in human gastric cancer cells via interleukin(IL)-6-Type cytokine signaling correlates with clinical implications[J].PloS One,2013,8(10):e75788.

[22]Hartman ZC,Poage GM,Den HP,et al.Growth of triple-negative breast cancer cells relies upon coordinate autocrine expression of the proinflammatory cytokines IL-6 and IL-8[J].Cancer Res,2013,73(11):3470-3480.

[23]Li L,Han R,Xiao H,et al.Metformin sensitizes EGFR-TKI-resistant human lung cancer cells in vitro and in vivo through inhibition of IL-6 signaling and EMT reversal[J].Clin Cancer Res,2014,20(10):2714-2726.

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on low metastatic hepatocellular carcinoma cells

Minghui YU1,Fuli WANG2,Tianran LI3

Fuli WANG;E-mail:wangfuli304@126.com

1Jinzhou Medical University PLA General Hospital First Affiliated Hospital Graduate Training Base,Jinzhou 121001,China;2Medical Department,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China;3Radiology Department,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81271607)and China Postdoctoral Foundation(No.2015M572810)

Objective:Toobservetheeffect of humanbonemarrowmesenchymal stemcells(BMSCs)onthegrowth,metastasis andapoptosis of hepatocarcinoma cells with low metastatic potential.Methods:Mouse model with low metastatic liver cancer cells were used.Mice were randomly divided into the model experimental group and the control group.In the experimental group,BMSCs(5×105)were injected into the tail vein of each mouse on the 7th day after inoculation with hepatocarcinoma cells.Mice in the control group were injected with the culture solution(0.2 mL per mouse)of BMSCs through the tail vein at the same time.The subcutaneous tumor volume was measured every week after the start of the experiment.Animals were sacrificed at day 14(2 weeks),day 21(3 weeks),day 28(4 weeks),day 35(5 weeks),and day 42(6 weeks)after inoculation of tumor cells.Complete dissection of the tumor blocks was done and the tumor inhibition rate was calculated by weight and volume.Real-time PCR was used to detect the expression of the osteopontin,bone salivary protein,and integrinαⅤgenes and the expression of Bcl-2,Bax,and caspase3 genes.Results:The inhibitory effect of BMSCs on tumor weight was statistically significant at 3 weeks.The tumor weight of the samples from the experimental group was significantly lower than that of the samples from control group.The inhibitory effect of BMSCs on tumor volume was statistically significant at 2,3,5,and 6 weeks.The tumor volume of the samples from the experimental group was significantly lower than that of the samples from the control group.The expression of pro-apoptotic factors,Bax and caspase3,in BMSCs was increased,and the expression of anti-apoptotic factor,Bcl-2,decreased gradually.Conclusion:BMSCs inhibited the growth of low metastatic hepatocellular carcinoma cells.The inhibition rate on tumor weight and volume was highest at the third week,and the tumor inhibition rate decreased gradually with time.

bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs),hepatocellular carcinoma(HCC),animal model,metastasis,apoptosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.23.184

①錦州醫(yī)科大學(xué)解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地（遼寧省錦州市121001）；②解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)部；③解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院放射科

*本文課題受國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81271607）和中國(guó)博士后基金（編號(hào)：2015M572810）資助

王福利 wangfuli304@126.com

（2017-10-25收稿）

（2017-12-12修回）

（編輯：鄭莉 校對(duì)：武斌）

禹名卉 專業(yè)方向?yàn)榱餍胁∨c衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)。E-mail：1213549627@qq.com