查冬青 吳小燕

·實(shí)驗(yàn)研究·

N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織的保護(hù)作用及機(jī)制

查冬青 吳小燕

目的通過對(duì)糖尿病腎病小鼠模型的研究，探討N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，AcSDKP)對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法將18只小鼠隨機(jī)分為正常組(n=6)、模型組(n=12)。通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptocozin，STZ)建立糖尿病小鼠模型，糖尿病模型建立成功后再分為糖尿病組(n=6)、糖尿病+AcSDKP組(n=6)。糖尿病+AcSDKP組小鼠予AcSDKP口服(1 mg·kg-1·2 d-1，溶于飲用水瓶中)，糖尿病組予常規(guī)飲用水。12周后測(cè)量小鼠血壓、心率、血糖，收集小鼠血、尿標(biāo)本用于檢測(cè)生化指標(biāo)及尿白蛋白/肌酐比值。處死大鼠后留取腎組織標(biāo)本，通過普通光鏡和電鏡觀察腎臟形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變。采用免疫熒光法檢測(cè)腎組織中足細(xì)胞蛋白(nephrin)的表達(dá)改變，采用免疫印跡法檢測(cè)腎組織纖連蛋白(fibronectin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)改變。結(jié)果①與對(duì)照組相比，糖尿病小鼠出現(xiàn)血糖明顯升高，建模成功后12周出現(xiàn)明顯白蛋白尿，足細(xì)胞出現(xiàn)足突融合、增寬，腎臟出現(xiàn)纖維化，腎小球表面面積及系膜區(qū)面積明顯增加，腎小球nephrin表達(dá)明顯減少，而糖尿病小鼠血壓無明顯改變。②AcSDKP 可減少糖尿病小鼠蛋白尿，減輕足細(xì)胞足突融合及增寬，緩解腎小球肥大及系膜增殖，改善腎臟纖維化。③AcSDKP 可減少腎組織fibronectin、α-SMA的表達(dá)，部分恢復(fù)腎臟nephrin的表達(dá)。結(jié)論AcSDKP可減輕糖尿病小鼠腎組織病變，其保護(hù)作用與減輕足細(xì)胞nephrin表達(dá)有關(guān)，為糖尿病腎病提供新的治療手段及理論依據(jù)。

N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸；糖尿病腎??；足細(xì)胞

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是終末期腎病的主要原因之一，是一種普遍纖維化增殖的腎臟疾病[1]。N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，AcSDKP)是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的N端活性位點(diǎn)的特異性底物[2]。研究發(fā)現(xiàn)，作為一種內(nèi)源性抗纖維化肽，AcSDKP可通過減輕炎癥、細(xì)胞分化、增殖和遷移來抑制心血管及腎臟疾病的纖維化[3-4]。本研究通過建立DN模型，探討AcSDKP對(duì)DN的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

材料與方法

一、模型制備和分組

18只無特定病原體動(dòng)物級(jí)體質(zhì)量25～30 g雄性 C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)，模型組(n=12)。模型組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，120 mg/kg)建立糖尿病模型，模型建立成功后再分為糖尿病組(n=6)、糖尿病+AcSDKP組(n=6)。糖尿病+AcSDKP組小鼠予AcSDKP口服(1 mg·kg-1·2 d-1，溶解于小鼠飲用水瓶中)，糖尿病組予常規(guī)飲用水。12周后處死小鼠。

二、標(biāo)本收集及檢測(cè)

各組小鼠處死前測(cè)量小鼠血壓、心率、血糖，收集小鼠血、尿標(biāo)本用于檢測(cè)生化指標(biāo)及尿白蛋白/肌酐比值。10%水合氯醛麻醉大鼠后，心臟采血，留取血標(biāo)本，應(yīng)用本院檢驗(yàn)中心Beckman自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐。迅速取出雙側(cè)腎臟，PBS漂洗，部分皮質(zhì)2.5%戊二醛固定，用于投射電鏡檢測(cè)；部分標(biāo)本于-80℃保存，制作冰凍切片，行免疫熒光及免疫印跡檢測(cè)。

三、主要試劑

鏈脲佐菌素(購于Sigma公司)；豚鼠足細(xì)胞蛋白(nephrin)單克隆抗體(購于Progen公司)；FITC標(biāo)記兔抗豚鼠二抗(購于北京中杉公司)。兔纖連蛋白(fibronectin)單克隆抗體、兔α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體購于abcam公司。

四、腎臟病理學(xué)檢測(cè)

(1)光鏡檢查：2 μm厚石蠟切片行常規(guī)PAS染色后鏡檢。

(2)透射電鏡檢查：固定、脫水、環(huán)氧樹脂包埋、切片，鈾、鉛雙重染色，透射電鏡觀察。

五、免疫印跡法檢測(cè)腎組織中fibronectin、α-SMA的表達(dá)

提取腎臟總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)濃度配平，在蛋白樣品中加入適量濃縮的4×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸變性。冷卻到室溫后，把等量蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔，SDS-PAGE電泳90 min，轉(zhuǎn)膜30 min。5%脫脂奶粉/TBST封閉抗原1 h后分別與兔纖連蛋白抗體、兔α-SMA抗體孵育過夜。對(duì)應(yīng)HRP二抗孵育后ECL顯影，膠片曝光分析。

六、免疫熒光檢測(cè)各組nephrin表達(dá)

3 μm腎組織冰凍切片用5%胎牛血清封閉30 min(37 ℃)，一抗(1∶50)孵育過夜(4 ℃)，以PBS代替一抗設(shè)立對(duì)照。次日復(fù)溫后PBS洗5 min×3次，用FITC標(biāo)記的二抗(1∶100)孵育90 min(37 ℃)。再次PBS洗5 min×3次，抗淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用one-way ANOVA分析組間差異。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組體質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量、血壓、心率、血糖及腎功能指標(biāo)改變

糖尿病小鼠血糖、腎質(zhì)量/體質(zhì)量明顯升高，體質(zhì)量、心率降低，AcSDKP干預(yù)后糖尿病小鼠體質(zhì)量有所上升，腎質(zhì)量/體質(zhì)量略有下降，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組之間血壓、尿素氮、肌酐無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(表1)

二、各組小鼠尿白蛋白改變

糖尿病小鼠建模成功12周后出現(xiàn)明顯白蛋白尿，AcSDKP可減少尿蛋白。對(duì)照組、糖尿病組、糖尿病+AcSDKP組尿白蛋白/肌酐分別為(0.37±0.12) mg·g-1·10-2、(1.14±0.31) mg·g-1·10-2、(0.58±0.16) mg·g-1·10-2。(圖1)

表1 各組小鼠指標(biāo)改變的比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01

圖1 各組小鼠尿白蛋白改變

三、小鼠腎臟病理改變

PAS染色分析顯示：腎小球表面面積明顯增加，AcSDKP可明顯緩解腎小球肥大。(圖2)

圖2 各組小鼠腎小球表面面積改變

電鏡顯示：足細(xì)胞出現(xiàn)足突融合、增寬；AcSDKP 減輕足細(xì)胞足突融合及增寬。(圖3)

圖3 各組小鼠足細(xì)胞改變(投射電鏡×10000)

Masson染色顯示：糖尿病小鼠腎臟出現(xiàn)纖維化，AcSDKP減輕腎臟纖維化。(圖4)

圖4 各組小鼠腎組織纖維化改變

四、各組小鼠腎組織中Fibronectin、α-SMA的表達(dá)改變

糖尿病小鼠腎組織中纖連蛋白、α-SMA表達(dá)明顯增加，而AcSDKP可抑制腎組織中Fibronectin、α-SMA的表達(dá)。(圖5)

圖5 各組小鼠腎組織Fibronectin、α?SMA的表達(dá)

五、各組小鼠腎組織nephrin的表達(dá)改變

免疫熒光顯示，糖尿病小鼠腎小球nephrin表達(dá)明顯減少，而AcSDKP 可部分恢復(fù)腎臟nephrin的表達(dá)。(圖6)

圖6 各組小鼠腎組織nephrin的表達(dá)

討 論

糖尿病腎病主要臨床特點(diǎn)表現(xiàn)為蛋白尿及腎功能異常[1]。糖尿病腎病一旦進(jìn)展為終末期腎病，需要行腎臟替代治療。

本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量降低，腎質(zhì)量/體質(zhì)量明顯升高，并出現(xiàn)明顯蛋白尿，腎小球表面面積明顯增加，部分小管間質(zhì)出現(xiàn)纖維化，腎組織中纖連蛋白、α-SMA表達(dá)明顯增加，提示該模型符合糖尿病腎病早期改變，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠足細(xì)胞出現(xiàn)足突融合、增寬，腎小球nephrin表達(dá)明顯減少，提示糖尿病可導(dǎo)致腎臟足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變及足細(xì)胞特異性標(biāo)記物表達(dá)異常，研究結(jié)果與Teng等[5]一致。

AcSDKP是由絲氨酸、天冬氨酸、賴氨酸及脯氨酸構(gòu)成的短肽，其前體是胸腺素(Tβ4)[6]。生理狀態(tài)下，AcSDKP可由賴氨酸寡肽酶通過水解Tβ4生成[6]。AcSDKP靜脈進(jìn)入人體后很快被降解，半衰期僅4～5 min。AcSDKP在體內(nèi)可被血管緊張素轉(zhuǎn)化酶迅速降解，使其濃度大大降低[7]，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可抑制AcSDKP水解，升高其在血漿中的濃度。AcSDKP是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑抗心臟和腎臟纖維化功能的構(gòu)成要素[4，8]。AcSDKP對(duì)多器官內(nèi)的多種類型細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)代謝和血管形成等方面有重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是在對(duì)心臟、肝臟、肺臟等器官抗纖維化方面起著重要作用[4]。研究證實(shí)，AcSDKP也可抑制高血壓大鼠心臟單核/巨噬細(xì)胞浸潤，抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖并減少間質(zhì)膠原沉積[9]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌成纖維細(xì)胞上存在AcSDKP特異性結(jié)合位點(diǎn)，AcSDKP通過與之結(jié)合抑制內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的膠原合成，同時(shí)抑制成纖維細(xì)胞內(nèi)鈣離子和絲裂原活化蛋白激酶細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化，從而發(fā)揮抗纖維化作用[10-11]。外源性AcSDKP可通過抑制肝星狀細(xì)胞增殖和活化，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解來治療四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化[12]。Peng等[13]應(yīng)用醛固酮-鹽性高血壓大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷贸鼋Y(jié)論，AcSDKP通過抑制腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞的增殖和膠原蛋白產(chǎn)生減輕了高血壓后的腎臟纖維化。Kanasaki等[14]發(fā)現(xiàn)AcSDKP能抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)誘導(dǎo)的Smad2磷酸化，使smad7的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用加強(qiáng)，TGF-β信號(hào)減弱，從而導(dǎo)致TGF-β誘導(dǎo)的靶基因血漿纖溶酶原激活物抑制因子、I型膠原mRNA表達(dá)減弱。AcSDKP不僅通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成發(fā)揮抗纖維化作用，還可通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解發(fā)揮抗纖維化作用。陳萍等[15]發(fā)現(xiàn)，AcSDKP上調(diào)大鼠矽肺模型中金屬蛋白酶-2、金屬蛋白酶-9的表達(dá)，通過促進(jìn)肺內(nèi)膠原降解發(fā)揮抗矽肺纖維化的作用。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)AcSDKP對(duì)糖尿病腎病尤其是減輕糖尿病腎臟纖維化起著重要的保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，AcSDKP可以減輕足細(xì)胞足突融合及增寬、部分恢復(fù)腎小球nephrin的表達(dá)，提示AcSDKP對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)機(jī)制可能與減輕足細(xì)胞損傷有關(guān)。

綜上所述，AcSDKP可減輕糖尿病小鼠腎組織病變，其保護(hù)作用與減輕足細(xì)胞nephrin表達(dá)有關(guān)，為糖尿病腎病提供新的治療手段及理論依據(jù)。

[1] Sharaf ED UAA,Salem MM, Abdulazim DO. Diabetic nephropathy: time to withhold development and progression-A review[J]. J Adv Res, 2017, 8(4): 363-373.

[2] Nitta K, Shi S, Nagai T, et al.Oral Administration of N-Acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline Ameliorates Kidney Disease in Both Type 1 and Type 2 Diabetic Mice via a Therapeutic Regimen[J].Biomed Res Int, 2016,2016(14): 1-11.

[3] Wang M, Liu R, Jia X, et al. N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline attenuates renal inflammationand tubulointerstitial fibrosis in rats[J].Int J Mol Med, 2010, 26(6): 795-801.

[4] Hrenak J, Paulis L, Simko F. N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (Ac-SDKP): potential target molecule in research of heart,kidney and brain[J].Curr Pharm Des, 2015, 21(35): S135-S143.

[5] Teng B, Schroder P, M ller-Deile J, et al. CIN85 Deficiency Prevents Nephrin Endocytosis and Proteinuria in Diabetes[J].Diabetes, 2016, 65(12): 3667-3679.

[6] Zuo Y, Chun B, Potthoff SA, et al. Thymosin β4 and its degradation product, Ac-SDKP, are novel reparative factors in renal fibrosis[J]. Kidney Int, 2013, 84(6): 1166-1175.

[7] Masuyer G, Douglas RG, Sturrock ED, et al. Structural basis of Ac-SDKP hydrolysis by Angiotensin-I converting enzyme[J]. Sci Rep, 2015, 25(5): 1-12.

[8] Kanasaki K, Nagai T, Nitta K, et al. N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline: a valuable endogenous anti-fibrotic peptide for combating kidney fibrosis in diabetes[J]. Front Pharmacol, 2014, 14(5):1-11.

[9] Sharma U, Rhaleb NE, Pokharel S, et al. Novel anti-inflammatory mechanisms of N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro in hypertension-induced target organ damage[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008, 294(3): H1226-H32.

[10] Zhuo JL, Carretero OA, Peng H, et al. Characterization and localization of Ac-SDKP receptor binding sites using 125I-labeled Hpp-Aca-SDKP in rat cardiac fibroblasts[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 292(2):H984-H993.

[11] Peng H, Carretero OA, Peterson EL, et al. N-Acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline inhibits ET-1-induced collagen production by preserving Src homology 2-containing protein tyrosine phosphatase-2 activity in cardiac fibroblasts[J]. Pflugers Arch, 2012, 464(4): 415-423.

[12] Chen YW, Liu BW, Zhang YJ, et al. Preservation of basa AcSDKP attenuates carbon tetrachloride-induced fibrosis in the rat liver[J]. J Hepatol, 2010, 53(3): 528-536.

[13] Peng H, Carretero OA, Brigstock DR, et al. Ac-SDKP reverses cardiac fibrosis in rats with renovascular hypertension[J]. Hypertension, 2003, 42(6): 1164-1170.

[14] Kanasaki K, Koya D, Sugimoto T, et al. N-Acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline inhibits TGF-beta-mediated plasminogen activator inhibitor-1 expression via inhibition of Smad pathway in human mesangial cells[J]. J Am Soc Nephrol, 2003, 14(4): 863-872.

[15] 陳萍, 楊方, 閆靜波, 等. 抗纖維化短肽對(duì)矽肺大鼠肺內(nèi)膠原合成與降解的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國職業(yè)醫(yī)學(xué), 2008, 35(4): 274-277.

ProtectiveroleofN-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-prolineinrenaltissueofmicewithdiabeticnephropathyandpossiblemechanisms

ZHADong-qing,WUXiao-yan.

DepartmentofNephrology,ZhongnanHospital,WuhanUniversity,Wuhan430071,China

WUXiao-yan,E-mail:wuxiaoyan2k6@163.com

ObjectiveTo investigate the role and possible mechanisms of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline(AcSDKP) in renal tissue of mice with diabetic nephropathy(DN).MethodsThe mice were randomly divided into control, diabetic mellitus (DM), and DM treated with AcSDKP (DM+AcSDKP) groups. The DM model was established by a single intraperitoneal injection of streptozotocin. Natrium citricumbuffer solution of same volume was intraperitoneally injected in the control group. The DM rats in AcSDKP group were orally administrated with AcSDKP (1 mg/kg every two days) for 12 weeks. Blood and urine samples were collected before mice were sacrificed 12 weeks later. The glomerular morphology and podocyte ultrastructure were observed under the light and transmission election microscopies respectively. The expression of nephrin was detected by immunofluorescence. Western blotting was used to detect the expression of fibronectin and α-SMA proteins in the renal tissues.Results(1) Albuminuria was increased 12 weeks after streptozotocin injection. DM mice displayed foot process fusion and broadening, renal fibrosis and increased glomerular surface area. The expression of nephrin was decreased in DM group. Blood pressure had no significant change in three groups. (2)AcSDKP decreased albuminuria, alleviated foot process fusion, ameliorated glomerular hypertrophy and renal fibrosis in DM mice. (3)AcSDKP decreased the expression of renal fibronectin and α-SMA, and restored the expression of nephrin in DM mice.ConclusionsAcSDKP alleviated the progression of DN via protecting against renal podocyte impairment.

N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline; Diabetic nephropathy; Podocyte; Nephrin

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.12.011

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No.81400694；No.81170679)

430071 武漢，武漢大學(xué)中南醫(yī)院腎內(nèi)科

吳小燕，E-mail：wuxiaoyan2k6@163.com

2017-08-06

2017-11-28)