郭建新，高 珂，祁 磊，謝萬福，徐高峰，馮 怡，李瑞春(西安交通大學：. 第一附屬醫(yī)院影像科；. 第一附屬醫(yī)院神經外科，陜西西安 7006；. 生物醫(yī)學工程系，陜西西安 70049)

神經鞘瘤中miR-10b基因表達和甲基化水平分析

郭建新1，高 珂2，祁 磊2，謝萬福2，徐高峰2，馮 怡3，李瑞春2
(西安交通大學：1. 第一附屬醫(yī)院影像科；2. 第一附屬醫(yī)院神經外科，陜西西安 710061；3. 生物醫(yī)學工程系，陜西西安 710049)

目的分析miR-10b小RNA在神經鞘瘤中的表達水平和該基因上游甲基化水平，并識別miR-10b在神經鞘瘤中的潛在靶基因。方法應用實時定量PCR定量miR-10b及潛在靶基因HOXB3、HOXD10、PTEN、PIK3CA、MAPRE1、HADC4在13例神經鞘瘤和6例正常前庭蝸神經的表達；進一步分析差異表達基因與神經鞘瘤臨床特征的相關性；最后應用焦磷酸測序分析兩組之間miR-10b基因上游甲基化水平差異。結果與正常神經相比，神經鞘瘤組織中miR-10b分子表達水平顯著升高(P=0.000 3)，而PTEN表達顯著下降(P=0.004 7)，兩者顯著負相關(P=0.001，r=-0.689)。此外，miR-10b基因啟動子區(qū)內甲基化水平下調，并與該基因表達顯著負相關(P=0.011，r=-0.571)。miR-10b高表達組與低表達組比較，腫瘤直徑有差異(P=0.016)；但發(fā)病年齡及1年后腫瘤復發(fā)率無差異(P>0.05)。結論神經鞘瘤中miR-10b啟動子甲基化水平下降引起該基因持續(xù)高表達，而miR-10b可能靶向抑制PTEN表達。

神經鞘瘤；miR-10b；甲基化；靶基因

神經鞘瘤又稱施旺細胞瘤(schwannoma)是一種起源于周圍神經施旺細胞的良性腫瘤。盡管該腫瘤生長速度緩慢，部分生長到一定大小后可停滯甚至萎縮，極少發(fā)生惡變，但因其壓迫神經和周圍組織，可引起神經功能受損和多種嚴重并發(fā)癥，包括聽力喪失、耳鳴、神經麻痹、腦積水等[1]。遺傳性神經鞘瘤多由神經纖維瘤病2(neurofibromin 2, Nf2)基因突變和功能缺失引起，呈現(xiàn)多發(fā)性和家族聚集特征；而散發(fā)性神經鞘瘤，僅部分患者出現(xiàn)NF2基因功能缺失[2]。目前，對驅動和維持神經鞘瘤特性的分子機制認識仍有限。miR-10b是近年來識別的一種促進腫瘤發(fā)生的微小RNA(microRNA)，在乳腺癌[3]、結直腸癌[4]、胃癌[5]、子宮內膜癌[6]、神經膠質瘤[7]中表達上調，通過靶向抑制特定基因表達來調控腫瘤細胞增殖和轉移。miR-10b在神經鞘瘤中的作用目前尚不清楚。本研究比較miR-10b分子及其潛在的靶基因在神經鞘瘤和健康神經組織中的表達變化，從DNA甲基化修飾上探索miR-10b分子表達調控機制，并分析miR-10b分子與神經鞘瘤病理特征之間的相關性。

1 材料與方法

1.1研究對象收集西安交通大學第一附屬醫(yī)院神經外科自2015年9月至2016年12月神經鞘瘤患者手術切除腫瘤組織樣本13例，其中男性7例，女性6例，聽神經瘤11例，脊髓神經鞘瘤2例。年齡29～61歲，平均年齡46.2歲。所有患者在手術前均未接受放療和化療，術后經病理確診為神經鞘瘤。此外，選取年齡和性別匹配的6個尸檢個體作為對照，解剖分離正常聽神經用于分析。

1.2miR-10b靶基因的選擇標準選擇標準包括：①在當前流行的6個小RNA靶基因預測工具(miRBase、miRanda、PicTar、MicroInspector、Diana-MicroT、TargetScanS)中有大于3個以上的工具預測其為靶基因；②以往文獻中應用報告基因檢測證實miR-10b可結合在靶基因3′-UTR區(qū)并下調基因表達。共篩選出候選靶基因8個，包括：HDAC4(Histone deacetylase 4)[8]、HOXB3(homeobox B3)、HOXD10(homeobox D10)[9]、PIK3CA(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha)[10]、PTEN(phosphatase and tensin homolog)[3]、MAPRE1(microtubule associated protein RP/EB family member 1)[11]、MICB(major histocompatibility complex class I polypeptide-related sequences B)[12]、ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)[10]。

1.3實時定量PCR(qRT-PCR)試驗Trizol法提取組織總RNA，應用逆轉錄試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA。應用Clontech公司“Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit”合成小RNA的cDNA。依照SYBR Green試劑說明書，混合樣品和檢測試劑，在Bio-Rad CFX96TM實時定量PCR平臺上開展檢測分析。PCR反應條件如下：95 ℃下1 min；95 ℃下30 s，60 ℃ 下30 s，72 ℃下30 s，以上三步重復35個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min。應用U6 snRNA分子和GAPDH分子作為內參，分別對miR-10b和靶基因表達量進行標準化，采用2-ΔΔCt法計算分子表達量。每個樣本重復定量三次，取平均值作為最終表達量。各分子的qRT-PCR引物序列見表1。

表1qRT-PCR試驗引物序列

Tab.1 The primer sequence used in qRT-PCR assay

1.4焦磷酸測序應用北京天根公司組織基因組DNA提取試劑盒提取腫瘤組織和對照正常神經組織DNA。使用Qiagen公司Epitect Bisulfite試劑盒對樣本基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理。對處理后DNA，PCR擴增miR-10b上游一段120 bp的CpG密集區(qū)(人類基因組版本，GRCh38.p7，2號染色體：176149149～176149268)。擴增引物序列為：正向5′-AGAAGAATGAGGGAATTTAT-3′；反向5′-ACCCCAATCTCTTCCTCT-3′。PCR反應條件如下：95 ℃下5 min；95 ℃下30 s，56 ℃下30 s，72 ℃下30 s，以上三步重復35個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸8 min。在Biotage AB公司PSQ HS96A焦磷酸測序平臺上完成焦磷酸測序，測序引物序列為：5′-ATTTGAATTGTTTTAGAAAG-3′。焦磷酸測序分析miR-10b上游-83、-76、-73、-57堿基位置上4個CpG二核苷酸位點(標記為CpG1～4)上胞嘧啶甲基化水平。

2 結 果

2.1miR-10基因表達和啟動子甲基化分析miR-10基因表達和甲基化與正常神經組織相比，神經鞘瘤miR-10b基因表達顯著上調，增加61.8%(P=0.000 3；圖1A)。此外，焦磷酸測序發(fā)現(xiàn)miR-10b上游4個CpG位點甲基化下降，其中CpG2和CpG3位點在Bonferroni校正后甲基化下調(P<0.05，圖1B)。此外，腫瘤組織miR-10b上游4個位點的平均甲基化水平也顯著低于正常對照神經(P=0.008，圖1B)。Pearson相關分析發(fā)現(xiàn)miR-10b甲基化水平與該基因表達顯著負相關(P=0.001，r=-0.689，圖1C)。

圖1正常組織和神經鞘瘤組織中miR-10b基因表達和甲基化水平的比較

Fig.1 Comparison of miR-10b expression and its DNA methylation between control and tumor tissues

A：正常神經和腫瘤組織miR-10b相對表達量變化倍數(shù)比較(P=0.000 3)；B：正常神經和腫瘤組織之間CpG1、CpG2、CpG3、CpG4和CpG1～4四個CpG上甲基化胞嘧啶平均值的比較結果，CpG2、CpG3和平均CpG1～4有統(tǒng)計學意義(P=0.009、P=0.002、P=0.008)；C：miR-10b相對表達量變化倍數(shù)與CpG1～4平均甲基化水平的Pearson相關分析(r=-0.689，P=0.001)。

2.2miR-10靶分子識別qRT-PCR基因表達結果應用qRT-PCR測定miR-10b分子潛在的8個靶基因在神經鞘瘤和正常神經組織中的表達量。與正常神經相比，腫瘤組織內HOXB3 和PTEN表達下降，在多重檢驗校正后仍具有統(tǒng)計意義(P<0.05，圖2B、G)。應用Pearson相關分析評估HOXB3和PTEN表達變化與miR-10b表達變化的相關性，發(fā)現(xiàn)PTEN和miR-10b表達顯著負相關(P=0.011，r=-0.571，圖2)。

2.3miR-10b與腫瘤臨床特征的相關性分析將13例神經鞘瘤按照miR-10b表達量分為高表達組(≥表達均值，6例)和低表達組(<表達均值，7例)。分別比較兩組之間，手術切除腫瘤組織最大直徑、腫瘤診斷年齡及隨訪1年后復發(fā)情況。我們發(fā)現(xiàn)miR-10b高表達組腫瘤直徑顯著大于低表達組[(2.83±0.69)歲vs.(1.64±0.69)歲，P=0.016]，而1年后復發(fā)率無顯著變化(高表達組2/6vs. 低表達組0/7，P=0.374)，而診斷年齡兩組無差異[(43.8±12.1)歲vs.(48.3±6.5)歲，P=0.482]。此外，我們比較3例雙側聽神經鞘瘤和8例單側聽神經鞘瘤miR-10b表達水平，未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。性別和體質量指數(shù)對腫瘤miR-10b表達亦無顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

DNA甲基化是一種調控基因表達的重要手段?；騿幼訁^(qū)域內CpG簇高甲基化修飾，可以阻遏轉錄因子和其他DNA結合蛋白結合，影響轉錄起始復合物形成，從而抑制基因表達[5]。DNA甲基化修飾是腫瘤發(fā)生中關鍵基因失活或過度激活的重要機制之一。以往基于候選基因啟動子甲基化分析的研究，已識別神經鞘瘤內存在差異甲基化修飾基因，如RASSIF1A基因[13]和p14ARF基因[14]。2015年，TORRES-MARTIN等[15]應用人450K甲基化芯片，分析36例聽神經鞘瘤和5例健康神經組織中散布于整個基因組上485 577個CpG位點甲基化水平，確定聽神經鞘瘤整體甲基化水平較正常神經組織下調，并報道HOX、MET、PMEPA1和miR-21等基因啟動子區(qū)低甲基化，伴隨表達上調。與該結果相似，本研究發(fā)現(xiàn)神經鞘瘤組織內miR-10b基因表達顯著上調，同時該基因上游甲基化水平下調。該基因甲基化水平與表達水平顯著負相關。已有證據(jù)揭示DNA甲基化轉移酶抑制劑5-aza-2′-deoxycytidine處理可降低胃癌細胞內miR-10啟動子甲基化水平，并增加該基因表達[5,11]。這些發(fā)現(xiàn)證實啟動子甲基化修飾可調控miR-10b表達。因此，神經鞘瘤內miR-10b啟動子區(qū)甲基化可能是上調該基因表達的原因。

圖2miR-10b候選靶基因表達及其與miR-10b表達水平的相關性

Fig.2 The expressions of candidate target genes of miR-10b in tumor tissues and controls and their correlation with miR-10b expression

A、C～F：靶基因HDAC4、HOXD10、MAPRE1、MICB和PIK3CA相對表達量變化倍數(shù)在正常神經和腫瘤組織之間比較無統(tǒng)計學意義(多重檢驗矯正α=0.05/8)；B、G、H：腫瘤組織靶基因HOXB3、PTEN和ZEB1相對表達量變化倍數(shù)低于正常神經組織(P=0.006，P=0.004 7，P=0.024 1)；I：PTEN和miR-10b相對表達量變化的Pearson分析呈負相關(r=-0.571，P=0.011)。

作為一種重要的促進癌癥發(fā)生的分子，miR-10b在多種腫瘤組織中普遍表達上調，并參與腫瘤侵襲和轉移過程[3,6,9]。考慮到miR-10b在其他腫瘤發(fā)生中的重要作用以及神經鞘瘤內miR-10b表達顯著上調，我們推測該分子可能是神經鞘瘤發(fā)生或發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。腫瘤直徑與miR-10b分子表達的相關性也支持這種猜測。我們發(fā)現(xiàn)高度表達miR-10b分子的神經鞘瘤更傾向于發(fā)展為大直徑的腫瘤，提示該分子可能在維持腫瘤生長中發(fā)揮了重要作用。神經鞘瘤生長緩慢，一部分腫瘤可持續(xù)生長擠壓周圍組織引起機體功能障礙和癥狀發(fā)生，而另外一部分則生長到一定程度后停滯或萎縮，因而相對危害較小[16]。預測神經鞘瘤生長特征和復發(fā)可能，對于治療方案制定具有重要意義。盡管我們的數(shù)據(jù)不支持miR-10b與術后神經鞘瘤復發(fā)的相關性，但考慮到本研究小樣本量(每組6～7例)有限的統(tǒng)計效能，我們認為尚不能排除miR-10b分子在預測腫瘤復發(fā)中的潛在價值。未來應該采取更大樣本的試驗探索這一問題。

microRNA是一類長約21～25個核苷酸的非編碼RNA，可轉錄后調節(jié)基因表達。microRNA能與靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′-UTR)堿基配對，通過抑制mRNA的翻譯或影響mRNA的穩(wěn)定性而發(fā)揮作用。miR-10b主要通過靶向抑制特定抑癌基因或調控細胞凋亡、周期或增殖功能的基因來參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3,6]。以往的研究證實PTEN基因，即同源性磷酸酶-張力蛋白是miR-10b促發(fā)腫瘤的一個重要靶基因。miR-10b基因通過結合于PTEN基因3′-UTR區(qū)域負性調控其表達，進而促進乳腺癌干細胞的自我更新能力[3]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)在神經鞘瘤中miR-10b表達與PTEN基因表達顯著負相關，提示在神經鞘瘤中miR-10b靶向下調PTEN基因表達。本研究與另一項研究[17]都證實神經鞘瘤中PTEN基因表達下降。PTEN基因是PI3K-AKT通路關鍵調控分子。該通路在細胞存活和自我更新、腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。有趣的是，此前的腫瘤表達譜研究也揭示PI3K-AKT信號通路在聽神經鞘瘤中過度表達，而抑制PI3K分子可以顯著降低腫瘤細胞活力[18]，促進腫瘤細胞死亡。綜上所述，神經鞘瘤中miR-10b啟動子甲基化水平下降引起該基因持續(xù)高表達，而miR-10b可能靶向抑制PTEN表達而上調PI3K-AKT信號通路，從而維持神經鞘瘤細胞存活和增值。我們的發(fā)現(xiàn)為進一步在原代培養(yǎng)神經鞘瘤細胞中研究miR-10b與PTEN之間的作用，探索PTEN調控PI3K-AKT信號通路的機制提供了線索。

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ExpressionofmiR-10bgeneandmethylationlevelinschwannomas

GUO Jian-xin1, GAO Ke2, QI Lei2, XIE Wan-fu2, XU Gao-feng2, FENG Yi3, LI Rui-chun2
(1. Department of Medical Image, the First Affiliated Hospitalof Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061; 2. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 3. Department of Biomedical Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, China)

ObjectiveTo analyze miR-10b expression level and the gene upstream methylation level in schwannomas so as to explore and identify the potential target genes for miR-10b in schwannomas.MethodsThe miR-10b with its potential target genes including HOXB3, HOXD10, PTEN, PIK3CA, MAPRE1 and HADC4 were quantitatively analyzed by PCR in 13 cases of schwannomas and 6 cases of human vestibulocochlear nerves. We studied the correlation between the differentially expressed genes and the clinical characteristics of schwannomas. Finally, the differences in miR-10b gene upstream methylation levels were measured and analyzed by pyrosequencing between schwannomas and normal vestibulocochlear nerves.ResultsCompared with that of normal nerves, the expression level of miR-10b was significantly higher (P=0.000 3) while the level of PTEN was lower (P=0.004 7) in schwannomas. Negative correlation existed between the levels of miR-10b and PTEN (P=0.001,r=-0.689). Moreover, the methylation level of the miR-10b gene promoter was downregulated in schwannomas; it had negative correlation with the expression level of miR-10b (P=0.011,r=-0.571). There was a significant difference in tumor mass diameter between miR-10b higher expression group and lower group (P=0.016); however, there was no difference in age or recurrence rate (P>0.05).ConclusionThe downregulation of methylation level of the promoter leads to higher expression of miR-10b gene, and it may targetedly inhibit the expression of PTEN.

schwannoma; miR-10b; methylation; target genes

2017-01-17

2017-09-18

西安交通大學綜合交叉項目(No.xjj2014145)

Supported by Comprehensive and Cross-disciplinary Project of Xi’an Jiaotong University (No.xjj2014145)

李瑞春，副主任醫(yī)師，博士. E-mail: lrckhz@126.com

優(yōu)先出版：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20171205.1538.014.html(2017-12-05)

R73

A

10.7652/jdyxb201801021

(編輯 韓維棟)