朱 琳 薛雅琳 劉曉輝 張 東 張東生,3

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院1，北京 100037) (普洱健源油脂有限公司2，普洱 665000) (江南大學(xué)3，無錫 214122)

氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定植物油中角鯊烯含量

朱 琳1薛雅琳1劉曉輝2張 東1張東生1,3

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院1，北京 100037) (普洱健源油脂有限公司2，普洱 665000) (江南大學(xué)3，無錫 214122)

通過內(nèi)標(biāo)類型和用量的選擇，在已有方法基礎(chǔ)上建立了一種內(nèi)標(biāo)法測(cè)定植物油中角鯊烯含量的氣相色譜法方法。以角鯊?fù)闉閮?nèi)標(biāo)，樣品經(jīng)氫氧化鉀-甲醇皂化，正己烷萃取，采用HP-5毛細(xì)管譜柱，程序升溫氣相色譜條件。結(jié)果表明，角鯊烯的平均回收率為95.5%～103.0%，精密度為1.42%～5.89%，檢出限為0.05 mg/kg。該方法不僅回收率高，重現(xiàn)性好，而且靈敏度高，該方法可用于測(cè)定植物油中角鯊烯含量，為科學(xué)評(píng)價(jià)植物油中營(yíng)養(yǎng)成分提供技術(shù)支撐。

角鯊烯 角鯊?fù)?內(nèi)標(biāo)法 植物油 氣相色譜法

角鯊烯是一種高不飽和的天然萜類化合物，屬于脂質(zhì)不皂化物，它最初是從鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，1914年被命名為Squalene，其化學(xué)名為(6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。它屬于開鏈三萜，又稱魚肝油萜，也稱鯊烯，具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、防癌、防心血管疾病、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能。因此，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品等相關(guān)領(lǐng)域[1]。

目前，國(guó)際AOAC(Revised 1996)標(biāo)準(zhǔn)中有測(cè)定角鯊烯含量的方法[2]，此方法通過不皂化物提取，柱色譜分離，最后采用滴定方法對(duì)角鯊烯進(jìn)行定量，檢測(cè)過程較為繁瑣，且最后采用滴定法測(cè)量，誤差較大[3]。文獻(xiàn)報(bào)道植物油中角鯊烯含量測(cè)定的方法較多，主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法等[4-9]。從采用的定量方式來看，利用高效液相色譜和氣相色譜法多采用外標(biāo)法定量，很少用到內(nèi)標(biāo)法，而氣質(zhì)聯(lián)用法在定量方式主要采用內(nèi)標(biāo)法定量。從采用的前理處理方法來看，主要有溶劑稀釋法、SPE柱法和皂化法。溶劑稀釋法直接進(jìn)樣，不僅會(huì)污染色譜柱，縮短色譜柱使用壽命，而且雜質(zhì)峰較多，影響與目標(biāo)峰的分離；SPE柱法雖說能去除大部分油脂雜質(zhì)，但是仍有部分雜質(zhì)會(huì)殘留，殘留下來的雜質(zhì)出峰時(shí)間較長(zhǎng)，且使用SPE進(jìn)行前處理油脂樣品上樣量小，對(duì)于角鯊烯含量較低的樣品不適用，從目前的文獻(xiàn)報(bào)道中看，也僅有角鯊烯含量較高的橄欖油用SPE進(jìn)行前處理，該法前處理檢測(cè)成本較高不適合推廣使用；由于角鯊烯屬于脂質(zhì)不皂化物，因此本研究在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上選擇不皂物提取經(jīng)典的方法——液液萃取法作為前處理方法。但不皂化物提取操作比較繁瑣，難免會(huì)有所損失，而內(nèi)標(biāo)定量方法會(huì)減少操作上的誤差，提高方法的準(zhǔn)確性。因此，本研究通過內(nèi)標(biāo)種類和用量的選擇，選出一種適用于氣相色譜法定量角鯊烯的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)角鯊?fù)?，建立一種以角鯊?fù)闉閮?nèi)標(biāo)測(cè)定植物油中的角鯊烯含量的氣相色譜法，該法不僅分離效果好、靈敏度高、回收率高且成本低，適合植物油中角鯊烯含量測(cè)定方法推廣使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特級(jí)初榨橄欖油、大豆油8種植物油：市售。

氫氧化鉀、乙醇、無水硫酸鈉均為分析純；正己烷為色譜純；角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)、5α-膽甾烷標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)sigma公司；角鯊?fù)闃?biāo)準(zhǔn)品(≥98%)：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；二十四烷標(biāo)準(zhǔn)品、正三十二烷標(biāo)準(zhǔn)品：北京百靈威科技有限公司。

7890A氣相色譜儀(FID檢測(cè)器)：安捷倫(Agilent)公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琪(Buchi)公司；氮吹儀：美國(guó)Organomation公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

準(zhǔn)確稱取25 mg角鯊烯、25 mg角鯊?fù)闃?biāo)準(zhǔn)品分別用正己烷定容于25 mL容量瓶，即配制成1 mg/mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和1 mg/mL內(nèi)標(biāo)角鯊?fù)闃?biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確移取300 μL角鯊?fù)閮?nèi)標(biāo)溶液于250 mL磨口燒瓶中，在氮吹儀上吹干后，準(zhǔn)確稱取0.2～2 g樣品于此燒瓶中，其余步驟同文獻(xiàn)[9]。

1.2.3 色譜條件

氣相色譜柱：HP-5毛細(xì)管柱，長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.32 mm，薄膜厚度0.25 μm；載氣：高純氮?dú)?純度99.999% )，恒壓：16 psi，分流比1∶10；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；柱溫采用程序升溫方式，以15 ℃/min的速率從160 ℃升溫到220℃，保持2 min，然后以5 ℃/min的速率升溫到280 ℃，保持20 min；最后以5 ℃/min的速率升溫到300 ℃，保持2 min；FID檢測(cè)器：溫度300 ℃，氫氣流速40 mL/min，空氣流速450 mL/min，尾吹氣流速30 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇

采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。內(nèi)標(biāo)物選擇的原則為內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是試樣中不存在的純物質(zhì)，這樣內(nèi)標(biāo)物能準(zhǔn)確加到樣品中去；內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征，最好與被分析物質(zhì)為同系物；同時(shí)，在色譜分析條件下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。根據(jù)以上特點(diǎn)，本研究從二十四烷、角鯊?fù)椤?α-膽甾烷、正三十二烷中篩選作為植物油中角鯊烯含量測(cè)定的內(nèi)標(biāo)，按1.2.3色譜條件進(jìn)行分析，這幾種內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間分別為二十四烷9.4 min，角鯊?fù)?2.9 min，5α-膽甾烷 19.4 min，三十二烷 20.6 min。通過8種植物油(花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特級(jí)初榨橄欖油、大豆油)進(jìn)行測(cè)定，只有角鯊?fù)槟芘c樣品中各組分完全分離，且各植物油本底不含內(nèi)標(biāo)角鯊?fù)椋瑫r(shí)，角鯊?fù)榕c角鯊烯結(jié)構(gòu)相似，出峰位置較為接近且可完全分離，滿足方法學(xué)中對(duì)內(nèi)標(biāo)的要求，因此，選用角鯊?fù)樽鳛榻酋徬庀嗌V法測(cè)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

2.2 內(nèi)標(biāo)加入量的選擇

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，內(nèi)標(biāo)加入量建議在待測(cè)物質(zhì)的濃度曲線的1/6～1/3處[10]。1～160 μg/mL角鯊烯與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，內(nèi)標(biāo)角鯊?fù)榧尤胭|(zhì)量濃度范圍應(yīng)為27～53 μg/mL。因此，加入終質(zhì)量濃度為30 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液可以滿足定量要求。

圖1 角鯊?fù)閮?nèi)標(biāo)加入量范圍

2.3 樣品稱樣量的確認(rèn)

根據(jù)本方法樣品最終定容至10 mL正己烷中，則對(duì)于角鯊烯含量≤800 mg/kg的植物油，加入終質(zhì)量濃度為30 μg/mL角鯊?fù)閮?nèi)標(biāo)，待測(cè)角鯊烯質(zhì)量濃度最高為160 μg/mL，則推薦稱樣量為2 g可滿足定量要求范圍。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，在植物油中橄欖油的角鯊烯含量較高，最高可達(dá)7 000～8 000 mg/kg，對(duì)于角鯊烯>800 mg/kg的植物油，加入終質(zhì)量濃度為30 μg/mL角鯊?fù)閮?nèi)標(biāo)，待測(cè)角鯊烯質(zhì)量濃度最高為160 μg/mL，則推薦稱樣量為0.2 g可滿足定量要求范圍。因此，根據(jù)樣品角鯊烯含量不同，稱量樣品進(jìn)行測(cè)定。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 校正因子

配制30 μg/mL角鯊?fù)閮?nèi)標(biāo)的角鯊烯工作液：將1 mg/mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用正己烷稀釋至質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、20、50、100、200、300、400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，并保證每個(gè)工作液中加入終質(zhì)量濃度為30 μg/mL的角鯊?fù)榈膬?nèi)標(biāo)。角鯊烯與角鯊?fù)榉迕娣e比為橫坐標(biāo)(X)，以角鯊烯與角鯊?fù)橘|(zhì)量比為縱坐標(biāo)(Y)，得到內(nèi)標(biāo)校正曲線為Y=1.010 7X，R2=0.999 8(n=4)，角鯊烯在質(zhì)量濃度范圍2.5～400 μg/mL與內(nèi)標(biāo)角鯊?fù)橘|(zhì)量濃度30 μg/mL呈良好線性關(guān)系且定量范圍較寬，該校正曲線的斜率1.010 7即為角鯊烯和角鯊?fù)榈男Ｕ蜃樱虼?，在給定的條件下，用氫火焰離子化(FID)檢測(cè)器檢測(cè)等量的角鯊烯和角鯊?fù)闀r(shí)可獲得相同的響應(yīng)值，即角鯊烯和角鯊?fù)榈男Ｕ蜃訛?.0。所以在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可不用配制角鯊烯與角鯊?fù)榈膬?nèi)標(biāo)校準(zhǔn)曲線，直接用加入樣品中的內(nèi)標(biāo)量進(jìn)行定量。

2.4.2 方法回收率和精密度

在已知角鯊烯含量的大豆油中分別加入不同濃度的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，低溫避光振蕩72 h，使角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品在大豆油中充分平衡，按建立的檢測(cè)方法進(jìn)行皂化、提取和檢測(cè)，計(jì)算角鯊烯在201.18～8 002.13 mg/kg添加水平的回收率(同一水平樣品組n=6)和精密度(RSD)。4個(gè)添加水平結(jié)果見表1所示，不同水平角鯊烯的回收率為95.5%～103.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.42%～5.89%。角鯊烯和角鯊?fù)榛旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2，加標(biāo)前后樣品色譜圖見圖3和圖4。

圖2 角鯊烯和角鯊?fù)榛旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液氣相色譜圖

圖3 加標(biāo)前樣品氣相色譜圖

圖4 加標(biāo)后樣品氣相色譜圖

表1 角鯊烯回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4.3 方法檢出限

以S/N≥3確定方法的檢出限，該方法角鯊烯的檢出限為0.05 mg/kg。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

分別取花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特級(jí)初榨橄欖油對(duì)其內(nèi)角鯊烯含量按方法1.2.3進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。由表2可知，橄欖油中角鯊烯最高為5 770.40 mg/kg，其他油中的角鯊烯含量較低，含量最低的為芝麻油，僅含14.74 mg/kg。

表2 7種食用植物油中角鯊烯的含量

3 結(jié)論

目前，利用液液萃取法提取植物油中角鯊烯的方法主要利用外標(biāo)法定量，但是由于液液萃取前處理方法操作較為繁瑣，難免會(huì)有所損失。本研究通過8種植物油(花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特級(jí)初榨橄欖油、大豆油)，4種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(二十四烷、角鯊?fù)椤?α-膽甾烷、正三十二烷)進(jìn)行篩選，選出一種適合氣相色譜法定量植物油中角鯊烯的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)角鯊?fù)椋挥薪酋復(fù)槟芘c樣品中各組分完全分離，且各植物油本底不含內(nèi)標(biāo)角鯊?fù)椋瑫r(shí)，對(duì)角鯊?fù)閮?nèi)標(biāo)加入量進(jìn)行選擇，建立一種以角鯊?fù)闉閮?nèi)標(biāo)定量角鯊烯的氣相色譜法，該方法加標(biāo)回收率為95.5%～103.0%，精密度為1.42%～5.89%，檢出限為0.05 mg/kg，由此可以看出，該方法不僅回收率高，重現(xiàn)性好，而且靈敏度高，該方法的建立不僅為植物油中角鯊烯的測(cè)定提供檢測(cè)參考，同時(shí)為下一步科學(xué)評(píng)價(jià)植物油營(yíng)養(yǎng)成分提供技術(shù)支撐。

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Determination of Squalene in Vegetable Oils by Gas Chromatography with an Internal Standard

Zhu Lin1Xue Yalin1Liu Xiaohui2Zhang Dong1Zhang Dongsheng1,3
(Science Academy of State Grain Administration1，Beijing 100037) (Pu’er Jianyuan Oil Co.，Ltd.2，Pu’er 66500) (Jiangnan University3，Wuxi 214122)

An analytical method based on the previous studies was developed for the determination of squalene in vegetable oils using internal standard by gas chromatography. Squalane was chosen as internal standard. The samples were saponified with potassium hydroxide-ethanol solution, then extracted byn-hexane, and analyzed by gas chromatography. Column HP-5 was used in the study. The results indicated that the average recovery rate of squalene was 95.5%～103.0% with relative standard deviations of 1.42%～5.89%. The limit of detection for squalene was 0.05 mg/kg. The method could be used for determination of squalene in vegetable oil with high recovery, good reproducibility and high sensitivity. It was suitable for the determination of squalene in vegetable oils, and also provided technical support for the scientific evaluation of nutritional components in vegetable oils.

squalene, squalene, internal standard method, vegetable oil, gas chromatography

TS 225.1

A

1003-0174(2017)12-0117-04

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD040 1403-3)

2016-12-26

朱琳，女，1984年出生，助理研究員，生物工程

薛雅琳，女，1960年出生，教授級(jí)高級(jí)工程師，糧油品質(zhì)及標(biāo)準(zhǔn)研究