張琛武，李衛(wèi)萍，郭寶林*，魏長玲

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030002)

·中藥農(nóng)業(yè)·

紫蘇醛型紫蘇不同種質(zhì)中紫蘇醛含量變化規(guī)律研究

張琛武1，2，李衛(wèi)萍1，郭寶林1*，魏長玲1

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030002)

目的研究紫蘇醛型種質(zhì)紫蘇醛含量變化規(guī)律。方法建立紫蘇醛含量檢測的快速方法，對9個(gè)不同種質(zhì)的紫蘇葉進(jìn)行不同日期、部位和時(shí)間取樣，并測定紫蘇醛含量。結(jié)果和結(jié)論9個(gè)紫蘇醛種質(zhì)的紫蘇醛平均含量為0.05%～0.32%，有4個(gè)種質(zhì)的平均含量在0.25%以上。一般來說頂部葉紫蘇醛含量最高，而且變化較大，開花前出現(xiàn)高峰值，之后驟降；中部葉紫蘇醛含量明顯低于頂部葉，一般開花前達(dá)到峰值后，含量較穩(wěn)定；底部葉紫蘇醛含量最大值出現(xiàn)在花果生長期，隨后一直下降。不同種質(zhì)也不甚一致。種質(zhì)因素是影響紫蘇醛含量的首要因素，采摘部位和采樣日期次之，一天內(nèi)的采摘時(shí)間則影響不大。

紫蘇；紫蘇醛；液相檢測；含量變化；種質(zhì)

紫蘇因揮發(fā)油中主要成分不同而分為不同的化學(xué)型[1]，《中華人民共和國藥典》(2015年版)規(guī)定紫蘇葉中紫蘇醛為檢出成分，即只有紫蘇醛型紫蘇葉為合格藥材?！度毡舅幘址健?第17版)則規(guī)定紫蘇葉中的紫蘇醛含量不得低于0.08%。本研究組前期調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)的紫蘇葉藥材以43份樣品中27份為紫蘇酮型(PK型)，紫蘇醛型(PA型)13份中僅有6份來自于栽培資源(其中2份為來自日本種源，并出口日本)，剩余是其他化學(xué)型[2]，又將調(diào)查獲得的50份果實(shí)種植后檢測，PK型33個(gè)，PA型8個(gè)(且多數(shù)直接或間接來自于日本)，以及其他化學(xué)型[3]。而PK型紫蘇因?yàn)槠渲兴咸K酮的毒性問題應(yīng)擯棄使用[1]，針對當(dāng)前正確的紫蘇醛型紫蘇資源短缺，本研究組搜集了9份紫蘇醛型紫蘇種質(zhì)，進(jìn)行種植后種質(zhì)評價(jià)，本文報(bào)道這些種質(zhì)在生長發(fā)育過程中紫蘇醛的含量變化規(guī)律。

1 儀器和材料

1.1 儀器和試劑

PerkinElmer Flexar 液相色譜儀、Agilent C18色譜柱(4.6×250 μm，5 μm)、ZD-85氣浴恒溫振蕩器(金壇市科析儀器有限公司)、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)

紫蘇醛對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：KR16-SW6P，純度≥98%)、甲醇(分析純，北京化工廠)、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)、水(娃哈哈飲用純凈水)

1.2 種質(zhì)來源

9份不同的種質(zhì)的來源和主要特性見表1。c4l和c4z為紫蘇變種，其余為回回蘇變種。2016年種植在藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)地，種植方法參見文獻(xiàn)[2]。

表1 種質(zhì)來源和主要特性

注：*表示c4l和c4z是同一來源的不同分化類型，區(qū)別為葉面顏色不同。

1.3 紫蘇生長發(fā)育時(shí)期和采樣時(shí)間

9個(gè)種質(zhì)中的生長發(fā)育期大多一致，集中在9月21日抽穗(也稱開花前期)，10月1日開始結(jié)實(shí)，10月11日結(jié)實(shí)，9月21日之前是營養(yǎng)期，9月21日-10月11日是開花期，10月11日～10月31日是結(jié)實(shí)期。有差異者大約10～20天，具體參見表2。

表2 紫蘇種植和生育期情況

注：—：直播未移栽；*：未能獲得具體時(shí)間。

1.4 采樣方法

紫蘇葉采摘分為三個(gè)部位，頂部葉設(shè)定為主枝及側(cè)枝尖端新生葉向下2～3分枝結(jié)節(jié)內(nèi)嫩葉(簡稱頂)；中部葉設(shè)定為主枝及側(cè)枝中間成熟葉片(簡稱中)；底部葉設(shè)定為主枝及側(cè)枝基部向上4～5結(jié)節(jié)分枝的老葉(簡稱底)。采樣時(shí)間從2016年8月23日開始到2016年10月31日結(jié)束，每10天左右采集一次樣本，每一次采樣，隨機(jī)選取15～20株，每株摘取葉片一枚，合并為一個(gè)樣品。每天采樣時(shí)間分早(7：00)、中(12：00)、晚(17：00)。采好的樣品于通風(fēng)避光處陰干。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

利用SPSS 19.0和WPS 2016對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理分析和繪制相應(yīng)圖例。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對照品溶液制備

精密移取100 μL紫蘇醛，用甲醇定容到100 mL容量瓶中，搖勻。準(zhǔn)確移取2.5 mL到25 mL容量瓶中用甲醇定容，得到0.1 μL·mL-1紫蘇醛對照品母液。

2.2 樣品溶液制備

紫蘇葉研碎成粉末，精密稱取0.5 g，準(zhǔn)確移取加入25 mL甲醇，搖床震搖10 min，超聲5 min，靜置，吸取適量上清液，過0.45 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)行液相檢測。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(5 μm，4.6×250 μm)柱；流動相：乙腈：水(65：35)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：230 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：30 μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，靜置，吸取適量，過0.45 μm有機(jī)濾膜，到液相小瓶中，進(jìn)行液相檢測。

2.5 精密度

取同一樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，測定紫蘇醛含量。結(jié)果樣品的的平均含量為0.07%，其RSD為0.89%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性

取同一樣品6份，按樣品測定方法操作，測定紫蘇醛含量。結(jié)果樣品的的平均含量為0.07%，其RSD為1.97%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性

取同一樣品溶液在0、2、4、8、12、24、48 h內(nèi)，測定紫蘇醛含量。結(jié)果樣品的的平均含量為0.07%(n=7)，其RSD為1.09%，表明方法穩(wěn)定性良好

2.8 回收率

精密稱取已知含量的紫蘇葉粉末0.5 g，按紫蘇醛含量1∶0.5、1∶1、1∶1.5各三份加入相當(dāng)量的紫蘇醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品測定方法進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果紫蘇醛的平均回收率為99.03%，RSD為1.83%(n=9)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 9個(gè)種質(zhì)紫蘇葉中紫蘇醛含量測定結(jié)果 (%)

表3(續(xù)) (%)

4 討論

4.1 影響紫蘇醛含量變化主要因素分析

利用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，綜合考察不同因素對紫蘇醛含量的影響程度，得到方差分析結(jié)果(見表4)。

表4 多因素方差分析

a.R2=0.600(調(diào)整 R2=0.585)

結(jié)果顯示，種質(zhì)、采摘部位和采樣日期這三個(gè)因素對紫蘇醛含量影響顯著，顯著性程度：種質(zhì)>采摘部位>采樣日期，而采摘時(shí)間的影響不顯著，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能認(rèn)為不同采摘時(shí)間的紫蘇醛含量有差別。

4.2 不同種質(zhì)

各紫蘇種質(zhì)的紫蘇醛平均含量在0.05%～0.32%(參見表3)，紫蘇醛含量從高到低依次是：c4z、c4l、b2、r1、b3、z2、f1、r2、b6，其中前4個(gè)種質(zhì)的平均含量在0.25%以上。

圖2直觀反映各種質(zhì)含量的分布狀況，b6、f1、r2、z2含量分布較為集中，且主要在0.2%以下；b3基本以0.2%為中值和集中分布，高低都有分布；b2、c4l、c4z、r1含量分布范圍跨度很大，隨不同的采收時(shí)間和植物的不同部位存在較大的變化幅度，而且存在高于0.4%，甚至高于0.6%(b2、c4l、c4z)的情況，說明這4個(gè)種質(zhì)的紫蘇醛合成還強(qiáng)烈地受到生長發(fā)育的調(diào)控，值得進(jìn)行深入研究。

圖2 不同種質(zhì)紫蘇醛含量頻數(shù)分布

4.3 不同采樣日期

紫蘇醛含量會隨著生長情況發(fā)生變化，各部位在采樣時(shí)間上發(fā)生的含量變化(見圖3)對于生產(chǎn)實(shí)踐的指導(dǎo)更有意義。

圖3 各部位不同采樣日期紫蘇醛含量

圖3顯示，頂部葉在9月21日，出現(xiàn)明顯峰值，之后下降，9月30日達(dá)到低谷后，略微回升。含量變化非常顯著。中部葉的變化趨勢和頂部葉類似，在9月21日，出現(xiàn)明顯峰值，之后下降，9月30日達(dá)到低谷后，略微回升，單9月21日的峰值不很高，后期的回升幅度和前期的峰值相差不大，也就是9月21日達(dá)峰值之后整體含量變化比較小。底部葉在9月30日才達(dá)到峰值，之后一直降低。

從生物量的角度來看中部葉>底部葉>頂部葉，中部葉是產(chǎn)量主要貢獻(xiàn)者，中部葉在后期含量相對穩(wěn)定。因此對于采收來說，或者在開始抽穗時(shí)采收，全部采收各種葉片，可以獲得最高含量的紫蘇葉藥材，如該種質(zhì)同時(shí)采收果實(shí)，則果實(shí)成熟后，采收頂部葉和中部葉片，也可以產(chǎn)出紫蘇醛含量較好的紫蘇葉藥材。

4.4 各種質(zhì)不同采摘部位

前文的研究證明，種質(zhì)是對紫蘇醛含量影響最大的主要因素，因此我們考察不同采摘部位紫蘇醛含量變化時(shí)，首先把種質(zhì)也作為區(qū)分進(jìn)行分析(見圖4)。

圖4 各種質(zhì)不同部位紫蘇醛含量

圖4顯示，各種質(zhì)基本上紫蘇醛含量在各部位(包括了不同的采摘時(shí)間和采樣時(shí)期的平均值)的分布情況是頂>中>底，只有r2顯示出中部葉含量高于頂部葉。Yuh-Jyuan Lee[6]的研究也表明紫蘇頂部葉的紫蘇醛含量要高于其它部位。

5 結(jié)論

5.1 影響紫蘇醛含量的因素

種質(zhì)因素是最主要因素，采摘部位和采樣時(shí)間次之，一天內(nèi)的采摘時(shí)間影響不大。

9月21日左右出現(xiàn)峰值，隨后有下降和回升現(xiàn)象，推測開花可能影響含量降低，但是通過對較為優(yōu)良的4個(gè)種質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)，達(dá)峰時(shí)間和紫蘇自身生育期關(guān)系并不嚴(yán)格對應(yīng)，開花期或開花期之前會達(dá)到峰值，每個(gè)特定種質(zhì)的具體情況還待進(jìn)一步深入研究。

頂部葉紫蘇醛含量最高，而且變化較大，開花前出現(xiàn)高峰值，之后驟降；中部葉含量顯著低于頂部葉，但是達(dá)到峰值后含量較穩(wěn)定；底部葉的含量達(dá)峰時(shí)間晚于前兩者，一般出現(xiàn)在花果生長期，隨后一直下降。

迄今研究過紫蘇醛型揮發(fā)油成分含量隨生長發(fā)育季節(jié)變化的研究很少，且使用GC/MS研究組分相對含量的變化[4-5]，但相對含量變化受組分構(gòu)成的影響，不能反映含量的準(zhǔn)確變化。

5.2 對于紫蘇葉采收方式的建議

紫蘇葉藥材根據(jù)紫蘇應(yīng)用途徑不同，采收方式有多種，產(chǎn)出的藥材質(zhì)量不同。根據(jù)本文的研究結(jié)果，開花期前采收頂部嫩葉，藥材品質(zhì)最優(yōu)；在生長期以不影響植物繼續(xù)生長的前提下持續(xù)采收中部成熟葉，則質(zhì)量優(yōu)良，但多次采收比較費(fèi)工，適合于需要后續(xù)應(yīng)用其他部位的情況；開花前期采收全部葉，質(zhì)量中等且不夠均勻，但是產(chǎn)量和成本最低；如以紫蘇果實(shí)為生產(chǎn)目標(biāo)，兼顧蘇葉資源綜合利用，則采收完果實(shí)同時(shí)采收全部葉，葉中紫蘇醛含量較低，品質(zhì)較差，可用于提取紫蘇葉揮發(fā)油。

[1] 魏長玲，郭寶林.紫蘇葉揮發(fā)油的不同化學(xué)型及研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2015，40(15)：2937-2944.

[2] 魏長玲，郭寶林，張琛武，等.中國紫蘇資源調(diào)查和紫蘇葉揮發(fā)油化學(xué)型研究[J].中國中藥雜志，2016，43(10)：1824-1834.

[3] 魏長玲.中國紫蘇種質(zhì)資源調(diào)查及紫蘇葉揮發(fā)油化學(xué)型研究[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2016.

[4] 魏長玲，張琛武，郭寶林，等.紫蘇葉揮發(fā)油化學(xué)型和組分影響因素探究I-不同生長發(fā)育期[J].中國中藥雜志，2017，42(4)：712-718.

[5] 邵平，洪臺，何晉浙，等.紫蘇精油主要成分季節(jié)性變化分析及其干燥方法研究[J].中國食品學(xué)報(bào)，2012，12(9)：216-221.

[6] Yuh-Jyuan Lee，Chwen-Ming Yang.Seasonal Changes of Growth and Leaf Perillaldehyde inPerillafrutescens(L.)Britton[J].Taiwan Agric.Res，2009，58(2)：114-124.

StudyonChangePatternofPerillaldehydeContentinDifferentGermplasmofPerilla

ZHANGChenwu1，2，LIWeiping1，GUOBaolin1，WEIChangling1

(1.ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030002；2.InstituteofmedicinalplantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193)

Objective：To study the change pattern of perillaldehyde content in perillaldehyde type germplasms.MethodsAn HPLC method for the quick determination of perillaldehyde content was established.Samples ofPerillafrutescensleaves from 9 different germplasms were collected at different dates，locations and times，and perillaldehyde content of the samples was determined.ResultsandConclusionThe average content of perillaldehyde in the 9 perilla germplasms was 0.05%～0.32%，and the average contents of 4 germplasms were above 0.25%.In general the top leaf perillaldehyde content is the highest，and the variety is bigger，highest before flowering，then drop after；middle leaf content is little lower than top leaf，the highest content appears generally before flowering，then relatively stable；the peak content of the bottom leaf occurs in the growth period of flower and fruit，then declining.Different germplasm is not very consistent.Germplasm is the most important factors affecting the content ofPerillafrutescens，and follows by the picking time and sampling date，but the picking time in the same day had little effect.

Perilla frutescens；perillaldehyde；content change；germplasm

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.013

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郭寶林，研究員；研究方向：中藥資源、鑒定、栽培；Tel：(010)57833134，E-mail：guoboalin010@163.com

2017-07-03)