張瑜，楊健*，趙玉洋，楊光，袁媛*，劉雅萍

(1.道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；2.大連普瑞康生物技術(shù)有限公司，遼寧 大連 116200)

·基礎(chǔ)研究·

UPLC-MS/MS法測定四種雪蓮培養(yǎng)物中九個(gè)維生素類成分含量△

張瑜1，楊健1*，趙玉洋1，楊光1，袁媛1*，劉雅萍2

(1.道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；2.大連普瑞康生物技術(shù)有限公司，遼寧 大連 116200)

目的建立超高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時(shí)測定4種雪蓮培養(yǎng)物中9個(gè)水溶性維生素類成分的方法，分析比較不同雪蓮懸浮細(xì)胞中維生素種類和含量差異。方法采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，以 10 mmol·L-1乙酸銨(A)-乙腈(B)溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，體積流量為0.5 mL·min-1，柱溫為40 ℃；采用電噴霧離子源、正離子檢測方式，得到相應(yīng)的提取離子流圖，以峰面積進(jìn)行定量。結(jié)果9個(gè)維生素類成分具有良好的線性關(guān)系，r值均大于 0.999 0，方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的RSD值均小于4.28%，加樣回收率在97.6%～103.4%，RSD在 1.83%～3.12%。不同雪蓮懸浮細(xì)胞中9個(gè)維生素類成分在組成和含量上無明顯差異。結(jié)論該方法操作簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于雪蓮懸浮細(xì)胞中水溶性維生素的測定。

雪蓮；維生素；UPLC-MS/MS

雪蓮，中藥名為雪蓮花，又稱石蓮、雪荷花，為菊科風(fēng)毛菊屬(Saussurea)植物天山雪蓮Saussureainvolucrata(Kar.et Kir.)Sch.-Bip.的干燥地上部分，是藏族民間常用藥，始載于藏族古代醫(yī)藥文獻(xiàn)《月王藥珍》[1]。雪蓮花整株入藥，性溫，味微苦，入肝、脾、腎三經(jīng)；具有散寒除濕、活血通絡(luò)、溫火助陽、抗炎鎮(zhèn)痛、縮宮等功效[2]，民間常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女小腹冷痛、閉經(jīng)和胎衣不下，以及麻疹不透、陽痿、肺寒咳嗽等癥[3]。雪蓮生長環(huán)境特殊，在海拔4000 m左右的懸崖峭壁之上，采摘不易；從扎根到開花需要5～7年的時(shí)間，加之其神奇的生物特征和獨(dú)特的藥理作用，被海內(nèi)外譽(yù)為“百草之王”、“藥中極品”[4]。近年來，全球變暖導(dǎo)致天山山脈雪面積減少，雪線上升，雪蓮生存的環(huán)境不斷縮?。辉偌由侠骝?qū)動(dòng)，掠奪性采挖導(dǎo)致野生天山雪蓮數(shù)量銳減。目前，雪蓮已被國務(wù)院列為國家三級(jí)瀕危植物[5]。雪蓮培養(yǎng)物是運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，甄選最佳野生天山雪蓮種源，在嚴(yán)格控制的培養(yǎng)條件下，使雪蓮細(xì)胞獲得最佳的生存環(huán)境和充足的營養(yǎng)，同時(shí)經(jīng)過上千次的篩選、培養(yǎng)，獲得優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)品。2010年，雪蓮培養(yǎng)物已被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品，其功效與天然雪蓮相似，在抗炎鎮(zhèn)痛、抗輻射、抗疲勞、抗氧化、提高免疫力等方面尤為突出[6]。雪蓮培養(yǎng)物作為雪蓮藥材的替代品，客觀上解決了雪蓮資源嚴(yán)重匱乏的問題；加之其具有種源純正、質(zhì)量穩(wěn)定、可持續(xù)供應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前市場上熱門的新食品原料。維生素與人體的生長發(fā)育和健康有著密切關(guān)系，是調(diào)節(jié)人體各種新陳代謝過程必不可少的重要營養(yǎng)元素，是食品中重要的功能因子。本研究以雪蓮培養(yǎng)物為研究對象，以9個(gè)維生素為指標(biāo)性成分，對其所含的維生素類成分進(jìn)行含量分析；該法重復(fù)性好，精密度高，準(zhǔn)確、靈敏，適合應(yīng)用于雪蓮培養(yǎng)物中維生素類成分的含量分析。

1 材料與儀器

1.1對照品

維生素類對照品共9個(gè)，分別是維生素B1、維生素B2、煙酸、煙酰胺、維生素B5(北京融誠鑫德科技發(fā)展有限公司)；維生素B4、維生素B6、維生素B7、維生素C(上海士峰生物科技有限公司)；純度均大于98%。

1.2 藥材

雪蓮培養(yǎng)物(大連普瑞康生物技術(shù)有限公司)，包括紅、粉、綠、白等4個(gè)色系。

1.3 儀器和試劑

ACQUITY UPLCTMI-Class系統(tǒng)(美國Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、EmpowerTM3色譜工作站)，API 6500四級(jí)桿-線性離子阱質(zhì)譜儀(美國ABSCIEX公司，配有離子噴霧接口)，SB-800 DTD型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，New Classic MS-S電子天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]，Eppendorf 5810R離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)。

色譜級(jí)甲醇和乙腈(美國Fisher Scientific公司)；甲酸(LC/MS分析用，美國Fisher Scientific公司)；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，以10 mmol·L-1乙酸銨(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0 min，5% B；1.4 min，5% B；4 min，55% B)，流速為0.5 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。對照品和樣品的提取離子流圖(XIC)見圖1、2。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：Turbo V，電離模式：ESI-，氣簾氣(CUR)體積流量：30 L·min-1；噴霧電壓(IS)：5500 V；霧化氣(GS1)體積流量：55 L·min-1；加熱輔助氣(GS2)體積流量：55 L·min-1；采集方式：MRM，離子化溫度(TEMP)：550 ℃。優(yōu)化的條件參數(shù)見表1。

表1 維生素類成分LC-MS/MS質(zhì)譜條件優(yōu)化

注：1.維生素B1；2.維生素B2；3.維生素B4；4.維生素B5；5.維生素B6；6.維生素B7；7.煙酸；8.煙酰胺；9.維生素C；下同。圖1 各維生素對照品提取離子流圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取樣品細(xì)粉 2.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率 250 W，頻率 40 kHz)40 min，稱定質(zhì)量，蒸餾水補(bǔ)足減少的質(zhì)量，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，放置于4 ℃冰箱供UPLC-MS/MS分析用。

2.2.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取維生素B1、維生素B2、維生素B4、維生素B5、維生素B6、維生素B7、煙酸、煙酰胺、維生素C對照品適量，其中維生素B1用10%的甲酸水溶液配成單一成分對照品儲(chǔ)備液，維生素B2用10%的氨水水溶液配成單一成分對照品儲(chǔ)備液，維生素B7用甲醇配成單一成分對照品儲(chǔ)備液，其他維生素用10 mmol·L-1乙酸銨-甲醇(9∶1)溶液分別配成單一成分對照品儲(chǔ)備液。精密量取上述9種對照品溶液適量，加蒸餾水配制成每1 mL含維生素B142.3 μg、維生素B26.42 μg、維生素B4177.00 μg、維生素B55.88 μg、維生素B63.81 μg、維生素B70.516 μg、煙酸8.22 μg、煙酰胺1.77 μg、維生素C 2.59 μg的混合對照品溶液，放置于4 ℃冰箱供UPLC-MS/MS分析用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 將上述混合對照品溶液進(jìn)一步稀釋成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積。以色譜峰面積Y為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)為縱坐標(biāo)得到各維生素的回歸方程分別為：維生素B1，Y=1.379×107X+4.082×107(r=0.999 6)，線性范圍：0.423～21.15 μg·mL-1；維生素B2，Y=2.613×107X-9.264 6×104(r=0.999 1)，線性范圍：0.032 1～3.21 μg·mL-1；維生素B4，Y=6.326×106X+4.806×106(r=0.999 6)，線性范圍：0.177～80.5 μg·mL-1；維生素B5，Y=1.761×106X+7.506×104(r=0.999 0)，線性范圍：0.058 8～5.88 μg·mL-1；維生素B6，Y=5.420×107X+1.540×106(r=0.999 5)，線性范圍：0.003 81～0.381 μg·mL-1；維生素B7，Y=5.464×106X+2.558×105(r=0.999 9)，線性范圍：0.002 58～0.258 μg·mL-1；煙酸，Y=2.039×106X+5.021×105，(r=0.999 4)，線性范圍：0.082 2～8.22 μg·mL-1；煙酰胺，Y=6.663×106X+1.147×105(r=0.999 5)，線性范圍：0.885～0.000 885 μg·mL-1；維生素C，Y=2.133×105X-1.338×104(r=0.999 3)，線性范圍：0.0644～1.297 μg·mL-1。

圖2 雪蓮培養(yǎng)物樣品提取離子流圖

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄9個(gè)維生素類成分的峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算其RSD在0.46%～2.41%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品5份，按照2.2.1制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算各維生素成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值在 1.53%～2.38%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品供試品溶液，分別在0、18、36、54、72、90 min測定9個(gè)維生素類成分的峰面積并計(jì)算其 RSD值在1.98%～4.28%，表明溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取雪蓮培養(yǎng)物樣品9份，向其中加入高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度(n=3)的對照品溶液。按照2.2.1方法處理后進(jìn)樣分析，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行 3次樣本分析，以計(jì)算所得的實(shí)際值與加入量的比值即為其準(zhǔn)確度。9個(gè)維生素的平均加樣回收率：維生素B1為98.5%，維生素B2為100.52%，維生素B4為102.6%，維生素B5為99.2%，維生素B6為98.6%，維生素B7為102.57%，煙酸為103.4%，煙酰胺為99.74%，維生素C 為97.6%，其 RSD 均小于3.12%。

3 樣品測定

取4種雪蓮培養(yǎng)物樣品，分別按照2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)條件分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算4種樣品中9個(gè)維生素類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表2 雪蓮培養(yǎng)物中維生素類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3)

4 討論

本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立同時(shí)測定4種雪蓮培養(yǎng)物中9個(gè)維生素灰成分含量的方法，具有準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。從含量測定結(jié)果來看，四種雪蓮培養(yǎng)物中，粉色培養(yǎng)物總維生素含量最高，可達(dá)420.08 μg·g-1，其次是白色培養(yǎng)物和紅色培養(yǎng)物，分別達(dá)403.37 μg·g-1和 340.6 μg·g-1，綠色培養(yǎng)物含量最低，只有216.7 μg·g-1。就單個(gè)維生素來看，維生素B4在4種培養(yǎng)物中含量均是最高的，是最主要的維生素來源。其他維生素含量相對較低。本研究的不足之處是缺乏雪蓮花藥材對照品，不能便于直觀地對比藥材和雪蓮培養(yǎng)物中各維生素含量差異。

[1] 陳金瑞，王葉富，邱林剛，等.藏藥雪蓮花的化學(xué)成分[J].植物分類與資源學(xué)報(bào)，1989(3)：271-275.

[2] 趙莉，王曉玲.新疆雪蓮的化學(xué)成分、藥理作用及其臨床應(yīng)用[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，29(4)：424-428.

[3] 趙德修，趙麗麗.雪蓮花的研究進(jìn)展[J].中草藥，1996，27(6)：372-374.

[4] 荊甜蕊，徐思雅，倪亦飛，等.天山雪蓮生物技術(shù)研究進(jìn)展[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，35(8)：2201-2210.

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ContentsDeterminationofNineVitamininFourKindsofSuspensionCellsofXuelianbyUPLC-MS/MS

ZHANGYu1，YANGJian1*，ZHAOYuyang1，YANGGuang1，YUANYuan1*，LIUYaping2

(1.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbsbreedingbase，NationalResourcesCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；2.PracticalBiotechnologyCo.，Ltd，Dalian116200，China)

Objective：To establish a UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of nine vitamins in four kinds of suspension cells of Xuelian，and analyze and investigate the difference of vitamin ingredients in samples from different suspension cells of Xuelian.MethodsThe determination was performed on the ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm ×2.1 mm，1.8 μm)；the 10 mmol·L-1ammonium acetate (A) and acetonitrile (B) in gradient elution as mobile phase.The flow rate was 0.5 mL·min-1.The column temperature was 40 ℃.The MS instrument was equipped with ESI-ion source.Gaining the extracted ion chromatograms.ResultsNine vitamins had a good linear relationship，and thervalues were more than 0.999 0.The RSD values of the precision，repeatability and stability were less than 4.28%.the recoveries were 97.6%-103.4%，the RSD was 1.83%-3.12%.There were no significant differences in the composition and content of nine vitamins in the suspension cells of different Xuelian.ConclusionThe method is simple，accurate and reproducible.It is suitable for the determination of water-soluble vitamins in the suspension cells of Xuelian.

Saussureainvolucrata；vitamin；UPLC-MS/MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.008

科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)(2015FY111500)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(ZZ10-008)；863項(xiàng)目(SS2014AA022201)

*

楊健，博士后，研究方向：中藥鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)，E-mail：yangchem2012@163.com；袁媛，研究員，研究方向：中藥鑒定與分子生藥學(xué)，E-mail：y_yuan0732@163.com

2017-06-05)