郝姍

摘 要 與其他植物相比，茶樹(shù)的組織培養(yǎng)起步較遲，但在當(dāng)今組織培養(yǎng)迅速發(fā)展的階段，其發(fā)展速度較快。因?yàn)榭芍貜?fù)性差、外植體褐化、完整植株獲得困難等情況的存在，茶樹(shù)組織培養(yǎng)至今仍未建立完善的高頻再生體系。基于此，總結(jié)了茶樹(shù)組培過(guò)程中，前人對(duì)外植體、培養(yǎng)條件選擇的研究結(jié)果，并從次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、種植資源保存和良種繁育推廣、加強(qiáng)基礎(chǔ)研究、與新的育種方法相結(jié)合四個(gè)方面對(duì)茶樹(shù)組織培養(yǎng)的研究工作提出展望。

關(guān)鍵詞 茶樹(shù)；組織培養(yǎng)；外植體

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.33.068

1 茶樹(shù)組織培養(yǎng)的意義

農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化是當(dāng)前農(nóng)業(yè)工作的重中之重。茶樹(shù)是我國(guó)傳統(tǒng)的特色經(jīng)濟(jì)作物，近年來(lái)隨著產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)優(yōu)良茶樹(shù)新品種的需求越來(lái)越迫切。傳統(tǒng)育種方法已培育出了一些產(chǎn)量高和品質(zhì)優(yōu)的品種，但生產(chǎn)上仍缺乏一些符合特定人群消費(fèi)需求的優(yōu)良品種，這主要是因?yàn)椴铇?shù)基因具有高度的雜合性，傳統(tǒng)的育種方法在改良茶樹(shù)品種方面難度較大。為更好地為茶農(nóng)創(chuàng)造較好經(jīng)濟(jì)效益，提升茶樹(shù)育種科技含量，將植物生物技術(shù)與茶常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合非常必要。生物技術(shù)在育種中的需要建立高頻率的遺傳轉(zhuǎn)化體系，高頻率的遺傳轉(zhuǎn)化體系則依賴(lài)于高頻率再生體系。茶樹(shù)組織培養(yǎng)快繁技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)用較少的植物材料進(jìn)行快速培育，生產(chǎn)出較多植株。茶樹(shù)組織培養(yǎng)具有生產(chǎn)周期短、繁殖系數(shù)高、易繼承親本的優(yōu)良性狀等特點(diǎn)。在茶樹(shù)實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)于優(yōu)良無(wú)性系品種快速繁殖體系的建立，加快茶新優(yōu)品種的推廣種植具有重大的實(shí)踐意義。

組織培養(yǎng)由于具有繁殖迅速、去除病毒等優(yōu)點(diǎn)而在茶樹(shù)繁殖上得以利用。但茶樹(shù)組培過(guò)程中的一些問(wèn)題，如愈傷組織易褐化、難以分化、基因不能按序表達(dá)等制約了茶樹(shù)組織培養(yǎng)的進(jìn)程。目前，要獲得經(jīng)過(guò)多次繼代培養(yǎng)的完整植株，同時(shí)保證植株在大田中存活仍有較大的難度，使組織培養(yǎng)在茶樹(shù)無(wú)性快繁、保存種質(zhì)資源、建立外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)等育種中的應(yīng)用還有較大距離。

2 茶樹(shù)組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

2.1 外植體選擇

20世紀(jì)60年代末，英國(guó)劍橋大學(xué)首次進(jìn)行了茶樹(shù)莖培養(yǎng)，用以研究咖啡堿的合成途徑[1]。日本的勝尾清等在同一時(shí)期開(kāi)展茶樹(shù)花藥培養(yǎng)試驗(yàn)[2]。20世紀(jì)70年代以來(lái)，我國(guó)茶樹(shù)組織培養(yǎng)開(kāi)始得到廣泛研究[1]。通過(guò)子葉柄和茶籽下胚軸的培養(yǎng)，直接分化出芽，得到了植株。廖利民[3]等通過(guò)葉柄的培養(yǎng)獲得了愈傷組織。嚴(yán)學(xué)成[4]等通過(guò)茶樹(shù)葉片培養(yǎng)的器官發(fā)生途徑得到了正常的互生葉小植株，并稱(chēng)有效克服了組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象。黃亞輝[5]也通過(guò)茶樹(shù)莖尖培養(yǎng)得到了愈傷組織。

不同外植體的離體反應(yīng)能力有很大差異，愈傷組織啟動(dòng)時(shí)間均不相同。葉片愈傷組織誘導(dǎo)率高于嫩莖，嫩莖誘導(dǎo)率又明顯高于根尖[6]。外植體的大小和起始培養(yǎng)物的幼嫩程度也影響愈傷組織產(chǎn)生和器官發(fā)生能力，一般幼嫩組織比老葉老莖更易誘導(dǎo)出愈傷組織[7]，不同茶樹(shù)品種的差異也會(huì)對(duì)芽的誘導(dǎo)和增殖有影響[8]。

目前，茶樹(shù)已經(jīng)從莖尖、腋芽、莖段、葉片、子葉、下胚軸、胚和花藥等成熟或未成熟組織中通過(guò)愈傷組織或直接產(chǎn)生不定芽的方式成功地進(jìn)行器官發(fā)生和植株再生[9]，但是以營(yíng)養(yǎng)器官為外植體的成功報(bào)道依然較少。

2.2 培養(yǎng)條件選擇

由于茶樹(shù)組培中選擇外植體種類(lèi)的不同，所選擇的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件也會(huì)有所差異。一般認(rèn)為，茶樹(shù)的組培使用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基較好，而溫度通常控制在（25±2）℃，光照為1 500～2 000 lx，光照時(shí)間為12～16 h，培養(yǎng)基pH為5.0～6.0。

岳川[10]等通過(guò)用茶樹(shù)的腋芽進(jìn)行芽的誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，CH的加入可明顯促進(jìn)芽的誘導(dǎo)，但細(xì)胞分裂素KT對(duì)促進(jìn)芽分化效果不如BA，在增殖階段用無(wú)生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基都可得到較好的增殖倍數(shù)。王云[11]認(rèn)為，葉片、莖段都能產(chǎn)生愈傷組織，但莖段的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率較低。王毅軍等[12]以茶樹(shù)葉片為外植體，以MS培養(yǎng)基附加4 mg/L 6-BA、2 mg/L IAA、

3 mg/L GA以及0.2%～0.3%活性炭誘導(dǎo)出了愈傷組織和胚狀體并形成小植株。張建華[2]以茶樹(shù)新梢腋芽、莖段為試驗(yàn)材料發(fā)現(xiàn)，外植體在培養(yǎng)基MS+BA4+NAA0.1中可誘導(dǎo)出愈傷組織并能分化出芽，但在繼代培養(yǎng)中以培養(yǎng)基ER+BA3+NAA0.1表現(xiàn)較好。彭正云[13]等對(duì)根為材料的研究中則認(rèn)為愈傷組織如不及時(shí)轉(zhuǎn)置新培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以后生長(zhǎng)十分緩慢，甚至停止生長(zhǎng)。而將愈傷組織輪換交叉置于不同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，其生長(zhǎng)比同一組分培養(yǎng)基培養(yǎng)的旺盛。周健[14]等認(rèn)為，茶樹(shù)幼胚的萌發(fā)需要有一定量的生長(zhǎng)素的刺激作用，但較強(qiáng)烈的細(xì)胞分裂素的作用對(duì)茶樹(shù)幼胚的萌發(fā)有抑制作用。張廣輝[15]等認(rèn)為，若要進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)，共培養(yǎng)基使用添加100 mmol/LAS的YMB培養(yǎng)基好于MS或MSOH培養(yǎng)基，可能是由于MS和MSOH培養(yǎng)基的高鹽濃度和低有機(jī)物質(zhì)含量對(duì)農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)和侵染有抑制作用。

劉德華[16]等以茶樹(shù)全胚、具有子葉柄的子葉為材料，研究500 lx、1 500 lx、黑暗3種光照條件對(duì)植株再生的影響。結(jié)果表明，子葉片隆起發(fā)生率隨光照度增加而降低；子葉柄的胚狀體、不定芽分化率隨光照度下降而下降；連續(xù)在黑暗下培養(yǎng)，子葉片的畸形胚發(fā)生率高，且數(shù)量多。在相同光照度下培養(yǎng)，全胚的總分化率低于子葉。N.V.Zagoskina[17]等的研究表明，UV-B（280～320nm）對(duì)于茶樹(shù)多酚類(lèi)物質(zhì)的累積有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用。同時(shí)研究中指出，該作用可能與愈傷組織光合細(xì)胞中的PSⅡ系統(tǒng)有關(guān)[18]。同時(shí)楊娟[19]等研究了LED光源不同光質(zhì)在植物組培方面的研究，并展望其在茶樹(shù)組培研究上的應(yīng)用。

3 目前存在的問(wèn)題

3.1 可重復(fù)性差endprint

由于茶樹(shù)的組培成功率與外植體來(lái)源的苗齡和部位關(guān)系密切，導(dǎo)致其可重復(fù)性差。一般來(lái)說(shuō)，外植體取材類(lèi)型、部位、季節(jié)、時(shí)間、葉位、是否留葉等因素的良好組合，將使外植體有優(yōu)良的萌發(fā)潛力和生長(zhǎng)表現(xiàn)。陳志輝[20]等在外植體性質(zhì)對(duì)茶腋芽組培快繁的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同品種對(duì)培養(yǎng)基組分適應(yīng)性有較大差異。除品種因素外，外植體所處生長(zhǎng)發(fā)育的生理狀態(tài)也有重要的作用。

3.2 外植體褐化

由于茶樹(shù)植株體內(nèi)多酚類(lèi)物質(zhì)含量很高，導(dǎo)致了外植體褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，并成為影響茶樹(shù)組織培養(yǎng)成功率的關(guān)鍵因素。此外，即使選用茶樹(shù)多酚含量較低的器官如幼根作為外植體，一旦形成愈傷組織又將產(chǎn)生大量多酚，造成愈傷組織發(fā)根和出芽困難，甚至褐化死亡。

楊亞萍[21]的實(shí)驗(yàn)表明，MS標(biāo)準(zhǔn)鐵鹽的0.5倍條件下外植體褐化率較低，而且生長(zhǎng)表現(xiàn)良好，外植體先用自來(lái)水沖洗過(guò)夜，再用45 ℃溫水浸泡15 min，能有效降低褐化率。鄔秀宏[22]認(rèn)為，在試驗(yàn)中將葉片的面積盡量切小，避免操作過(guò)程中外植體受損均能夠減少褐化面積。

3.3 完整植株獲得困難

研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)組織培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織的產(chǎn)生，苗和根的分化遵循普遍原則：激動(dòng)素/生長(zhǎng)素比例高時(shí)形成苗，比例低時(shí)形成根。但是目前完整植株的獲得帶有一定的隨機(jī)性。主要是因?yàn)檎T導(dǎo)苗和根形成的激素濃度范圍往往較狹窄，而且不同的茶樹(shù)品種，不同的外植體所需的激素種類(lèi)及濃度均不同。張廣輝[15]等認(rèn)為，茶樹(shù)在誘導(dǎo)發(fā)根成功后易再生出芽，因此可以建立完善的發(fā)根誘導(dǎo)體系，但目前尚缺乏進(jìn)一步的報(bào)道。

3.4 營(yíng)養(yǎng)器官組織培養(yǎng)研究有待進(jìn)一步深入

目前，以茶樹(shù)生殖器官為外植體組培成功的案例較多，但以茶樹(shù)營(yíng)養(yǎng)器官尤其是莖段作為外植體的報(bào)道較少。以子葉等作為外植體易誘導(dǎo)出愈傷組織，但子葉體胚遺傳背景與母體的差別很大，因此應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)與母體遺傳背景一致的營(yíng)養(yǎng)器官作為外植體的研究。

4 研究展望

4.1 次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

茶樹(shù)富含多酚、咖啡堿、茶氨酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物，組織培養(yǎng)在形成愈傷組織之后這些次級(jí)代謝產(chǎn)物開(kāi)始在體內(nèi)堆積，因此組織培養(yǎng)對(duì)于研究次生代謝產(chǎn)物的合成機(jī)制有重要的意義。同時(shí)優(yōu)化茶樹(shù)次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的組培條件和分離提純方法能能夠有效降低其生產(chǎn)成本，彌補(bǔ)天然資源的不足。

4.2 種植資源保存和良種繁育推廣

目前，我國(guó)的很多茶樹(shù)品種都逐漸被無(wú)性系良種所取代，所以可望通過(guò)組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行茶樹(shù)種質(zhì)資源的保存，特別是不育或敗育率很高的品種，這對(duì)節(jié)約空間、時(shí)間及維持我國(guó)茶樹(shù)品種的多樣性不可或缺。茶樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)只需要很少的植物組織就可以獲得大量的植株，不受季節(jié)、氣候的限制，是加快茶樹(shù)繁殖速度，有利于良種繁育推廣的重要手段。

4.3 基礎(chǔ)研究進(jìn)一步加強(qiáng)

目前，茶樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)雖然發(fā)展迅速，但是相對(duì)于其他植物的組織培養(yǎng)而言由于起步較遲，基礎(chǔ)研究仍然相對(duì)薄弱，如環(huán)境對(duì)于組培過(guò)程和內(nèi)含物質(zhì)積累的影響研究還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。此外，抑制褐化和激素配比等問(wèn)題也需要更進(jìn)一步的研究。

4.4 與新的育種方法相結(jié)合

利用植物生物技術(shù)與常規(guī)的育種技術(shù)相結(jié)合，互相取長(zhǎng)補(bǔ)短、縮短育種時(shí)間、提高效率。在茶樹(shù)育種中，應(yīng)用單倍體培育、原生質(zhì)體融合體細(xì)胞雜交、胚培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等能夠較快地獲得穩(wěn)定的具有某些優(yōu)良性狀品種，培育出新一代的茶樹(shù)優(yōu)質(zhì)品種，才能有更高產(chǎn)量、更好品質(zhì)的茶產(chǎn)品的收獲，但這些育種方式最終都需要組織培養(yǎng)來(lái)獲得目的植株。因此，加快建立完善茶樹(shù)組培再生體系并與新型育種方法相結(jié)合對(duì)于茶樹(shù)新品種培育具有重要的意義。

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（責(zé)任編輯：趙中正）endprint