涂俊凡+秦仲麒+李先明+伍濤+楊夫臣+朱紅艷+劉政+楊立

摘要：以早熟砂梨品種鄂梨2號組培苗葉片為外植體，建立葉片再生體系。結(jié)果表明，鄂梨2號葉片再生不定芽最佳培養(yǎng)基為NN69+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L IBA，愈傷組織再生率達(dá)到100%，不定芽再生率為36.67%；不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，增殖系數(shù)為2.19；不定芽在1 000 mg/L ABT中浸蘸5 s后接種在添加500 mg/L活性炭的1/2MS培養(yǎng)基上，生根率最高，為66.67%；試管苗移栽成活率為84.44%。

關(guān)鍵詞：砂梨；鄂梨2號；組培苗葉片；再生

中圖分類號：S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）23-4613-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.049

Abstract： Leaves excised from Eli 2 Hao were used as explants to establish regeneration system. The results indicated that the maximum adventitious buds regeneration frequency achieved 36.67% on the mediu of NN69+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L IBA. The most suitable medium for shoot multiplication was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA and the average multiplication coefficient was 2.19. The buds were dipped in 1 000 mg/L ABT for 5 s and inoculated on 1/2MS medium with 500 mg/L activated carbon. The highest rooting rate was 66.67%， and the survival rate of plantlets was 84.44%.

Key words： sand pear； Eli 2 Hao； leaf； regeneration

鄂梨2號是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所選育的優(yōu)質(zhì)早熟砂梨新品種，果實(shí)7月中下旬成熟。果皮黃綠色，果實(shí)倒卵圓形，平均單果質(zhì)量200 g，含可溶性固形物12.0%～14.7%，總酸0.14%～0.16%[1]。本研究以早熟砂梨品種鄂梨2號試管苗葉片為試材，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)與增殖以及生根等培養(yǎng)基的篩選，建立葉片高效再生體系，為鄂梨2號梨的規(guī)?；敝?、遺傳轉(zhuǎn)化改良及無性系變異篩選奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為早熟砂梨品種鄂梨2號[Pyrus pyrifolia Nakai.cv.Eli 2 No.2]，組培苗來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所實(shí)驗(yàn)室，葉齡30 d左右，外植體為長勢良好的葉片。

1.2 葉片不定芽誘導(dǎo)

取繼代培養(yǎng)4～5周、長勢較為一致的試管苗上部葉片，在無菌條件下，將葉片切割成大小為0.5～1.0 cm×0.5～1.0 cm的葉盤，每個處理接種20個外植體，重復(fù)3次，接種在附加TDZ和IBA的NN69、MS培養(yǎng)基上，30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂、pH 5.8。暗培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，光照1 500 lx，光周期16 h/d。接種后60 d統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。不定芽誘導(dǎo)率=萌芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.3 不定芽的增殖

將葉片上誘導(dǎo)的不定芽接種在不同處理的MS增殖培養(yǎng)基上。①細(xì)胞分裂素對鄂梨2號組培苗增殖的影響：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 6-BA共5個濃度梯度。②生長素對鄂梨2號組培苗增殖的影響：0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L NAA；0.05、0.10、0.20 mg/L IBA。20 d后統(tǒng)計(jì)不定芽。

1.4 組培苗生根與移栽

組培苗生根：切取長約2 cm生長健壯的不定芽，在不同培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。浸蘸生根法：組培苗基部在1 000 mg/L ABT溶液中浸泡5 s后，接種在不同培養(yǎng)基中。每處理30個外植體，重復(fù)3次，暗培養(yǎng)2周，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

組培苗移栽：用23 cm×18 cm的營養(yǎng)缽做移栽容器，將根長0.5 cm以上的試管苗放在溫室中煉苗，加遮陽網(wǎng)閉瓶煉苗7 d，開瓶煉苗1 d后，洗凈根系，移栽入不同基質(zhì)的營養(yǎng)缽中。塑料拱棚保濕，上蓋遮陽網(wǎng)。每天適量澆水，30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對鄂梨2號葉片不定芽再生的影響

由表1可知，基本培養(yǎng)基的種類及激素濃度對鄂梨2號不定芽再生有顯著影響。處理A6不定芽分化率最高（36.67%），不定芽數(shù)量較多，莖、葉明顯，長勢好；處理A8出芽率次之，不定芽數(shù)量較多，長勢較好。鄂梨2號葉片接種后，暗培養(yǎng)7 d左右，葉片開始膨大（切口和葉脈處明顯膨大）；21 d左右出現(xiàn)芽點(diǎn)；30 d后，芽點(diǎn)發(fā)育成明顯小芽。鄂梨2號葉片接種在NN69+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上，21 d暗培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，愈傷組織再生率100%，不定芽再生率36.67%。

2.2 不定芽增殖

2.2.1 細(xì)胞分裂素對鄂梨2號組培苗增殖的影響 鄂梨2號葉片不定芽接種在添加0.1 mg/L IBA和不同濃度6-BA的MS培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，6-BA濃度為0.5～1.5 mg/L時，不定芽正常增殖，且隨著濃度增加，組培苗增殖系數(shù)增加。6-BA濃度大于2.0 mg/L時，組培苗易玻璃化（表2）。endprint

2.2.2 生長素對鄂梨2號組培苗增殖的影響 鄂梨2號葉片不定芽接種在添加1.0 mg/L 6-BA和不同濃度的NAA和IBA的MS培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，添加不同濃度的NAA和IBA對鄂梨2號組培苗生長勢有較大影響。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.02～0.05 mg/L NAA，繼代的組培苗生長健壯，葉片淡綠，NAA濃度高于0.1 mg/L時，組培苗基部生成較多愈傷組織。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10～0.20 mg/L IBA，繼代的組培苗生長健壯，IBA濃度低，繼代的組培苗生長緩慢，濃度為0.30 mg/L時，組培苗細(xì)弱（表3）。

2.3 不同生根劑及處理方法對組培苗生根的影響

鄂梨2號組培苗在高濃度的生根劑中浸蘸的生根效果優(yōu)于添加低濃度生根劑的培養(yǎng)基。鄂梨2號組培苗在1 000 mg/L ABT中浸蘸5 s后接種在添加500 mg/L活性炭的1/2MS培養(yǎng)基上，生根率最高，為66.67%。組培苗在添加不同濃度生根劑的培養(yǎng)基上，生根率僅為8.33%～16.67%（表4）。

2.4 組培苗移栽

移栽基質(zhì)對組培苗移栽成活率有重要的影響。不同移栽基質(zhì)組培苗成活率差異很大，蛭石和珍珠巖（體積比2∶1）作為移栽基質(zhì)時成活率最高，為84.44%；蛭石和珍珠巖（體積比1∶1）作為移栽基質(zhì)效果次之，為61.11%，蛭石作為移栽基質(zhì)的生根率為45.56%；蛭石和草炭配比的基質(zhì)效果最差，為22.22%（表5），生根組培苗移栽第一周部分已腐爛。圖1為鄂梨2號葉片組織培養(yǎng)再生。

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類包括MS、1/2MS、NN69、WPM等[2-10]，大量研究結(jié)果證明NN69比較適宜梨品種葉片再生[2-4]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。以NN69為基本培養(yǎng)基，添加TDZ和IBA兩種生長調(diào)節(jié)劑，建立了鄂梨2號葉片離體直接再生體系，使鄂梨2號的組培苗工廠化生產(chǎn)成為可能。

細(xì)胞分裂素（6-BA等）與生長素（IBA等）配合使用，比例協(xié)調(diào)時可促進(jìn)芽苗增殖及伸長生長[2，5]。本試驗(yàn)在不定芽繼代增殖過程中，配比使用6-BA、NAA或IBA，促進(jìn)了不定芽的增殖和伸長生長，組培苗增殖系數(shù)偏低，長勢較好。組培苗增殖過程中，繁殖系數(shù)過高，會引起組培苗弱化，生長勢變差。一般可通過降低細(xì)胞分裂素濃度降低高代次繁殖系數(shù)，而維持較高的平均繁殖系數(shù)和較好的試管苗長勢，有關(guān)問題需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)通過組培苗在高濃度的生根劑中浸蘸后接種在不含植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，生根率達(dá)到66.67%，且生根時間較短。根原基的啟動和形成階段生長素起關(guān)鍵作用，而根原基的伸長和生長則可以在沒有外源生長素的條件下實(shí)現(xiàn)。生長素可能主要在根的誘導(dǎo)和發(fā)端起作用，但根原基形成后，較高濃度的生長素的繼續(xù)存在則不利于幼根的生長發(fā)育。本試驗(yàn)成功建立了鄂梨2號葉片不定芽分化和植株再生體系，為鄂梨2號的遺傳轉(zhuǎn)化和基因工程育種打下了基礎(chǔ)。

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