金鈺+周有祥+胡定金+趙明明

摘要：通過高效液相色譜法分析81份來自湖北不同地區(qū)茶葉樣品中的特征峰，外標法計算兒茶素含量，建立數(shù)據(jù)庫。利用主成分分析法和貝葉斯判別分析方法找到6個地區(qū)綠茶間兒茶素與咖啡因含量的差別。結(jié)果表明，通過主成分分析，提取出兩個主成分，累計貢獻率為62.5%，區(qū)分效果不理想；采用貝葉斯判別分析，對恩施地區(qū)的茶葉判別正確率達90.0%，對湖北茶葉有一定的區(qū)分效果。

關(guān)鍵詞：茶葉；兒茶素；咖啡因；主成分分析；貝葉斯判別分析

中圖分類號：TS272；Q946.84+1；O212.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）23-4588-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.043

Abstract： The contents of characteristic peaks in 81 green tea samples from different areas in Hubei province were measured by high-performance liquid chromatography（HPLC）. Then external standard method were used to calculate catechins contents to establish the database. The different contents of catechins and CAF from 6 areas of Hubei were analyzed by principal component analysis（PCA） and bayes discriminant analysis. The results showed that 2PCs could be extracted by PCA， the cumulative contribution rate was 62.5%， but the distinguish effect was not ideal. Using bayes discriminant analysis， discriminant accuracy of Enshi tea was 90.0%， and the differentiation of hubei tea had certain effect.

Key words： tea； catechins； caffeine； principal component analysis； bayes discriminant analysis

綠茶是中國消費的主要茶類，品類繁多，特征各異。而湖北省是“茶圣”陸羽的故鄉(xiāng)，產(chǎn)茶歷史悠久，茶區(qū)生態(tài)環(huán)境優(yōu)越，茶文化底蘊深厚。近年來，湖北省已經(jīng)擁有了武當?shù)啦?、蕭氏茗茶、鶴峰翠泉茶、英山云霧茶、大悟綠茶等知名品牌茶，在全國茶葉產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。茶葉干物質(zhì)主要有蛋白質(zhì)、糖類、多酚類、脂類、生物堿、氨基酸等[1-4]，生物堿咖啡因（Caffeine）含量最多，多酚類物質(zhì)主要由兒茶素組成，包括表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、兒茶素（Catechin，C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、兒茶素沒食子酸酯（Catechin Gallate，CG）、沒食子兒茶素（Gallocatechin、GC）[5，6]。目前，已有多種分析方法應(yīng)用于鑒定不同地區(qū)的茶葉品種，主要有近紅外光譜分析法[7]、高效液相色譜法[8，9]、氣相色譜法、氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]。本研究以茶葉中的特征化學(xué)成分，主要是茶多酚與咖啡因為研究對象，通過高效液相色譜方法分析來自湖北不同地區(qū)的綠茶樣品，再利用統(tǒng)計學(xué)技術(shù)，以期建立湖北綠茶產(chǎn)地溯源的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

共采集81個綠茶樣品，采自湖北省恩施（11個）、黃岡（10個）、宜昌（20個）、鶴峰（13個）、赤壁（6個）、通城（21個）等地區(qū)，粉碎后過20目篩，4 ℃下密封保存。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子酸兒茶素（EGC）、表兒茶素（EC）、兒茶素（C）和咖啡因（CAF）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、兒茶素沒食子酸酯（CG）、沒食子兒茶素（GC）購自Sigma公司（USA）。

1.2 儀器與試劑

離心機、Waters 2695-2998 HPLC系統(tǒng)（美國，Waters公司）；甲醇、磷酸等試劑。

1.3 方法

1.3.1 樣品測定 稱取0.05 g左右的茶葉干樣于10 mL離心管中，按照樣品序號編號，加入5 mL 80 ℃水，于振蕩儀上振蕩混勻，后放入80 ℃水浴10 min，于3 000 r/min離心10 min后上清液置于4 mL離心管中，將所得上清液過0.22 μm濾膜，進入高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)進行分析。

1.3.2 標準溶液配制 精確稱量EGCG、ECG、EGC、EC、GCG、CG、GC、C和CAF，溶于70%甲醇溶液中，濃度約為100 μg/mL。

1.3.3 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS-4 C18 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長為278 nm，流動相A為4.5%（V/V）的磷酸溶液，流動相B為甲醇，D為去離子水。流動相梯度變化見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

樣品經(jīng)HPLC分析得到21個特征峰，通過標準品確認其中9個峰為GC、EGC、C、EGCG、CAF、EC、GCG、ECG和CG，通過外標法計算含量，后采用SIMCA-P軟件和R studio軟件進行樣品的主成分分析和貝葉斯判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

為了比較不同提取方法和提取溶劑的優(yōu)劣，試驗中以去離子水、50%甲醇、50%乙醇、50%乙腈為提取溶劑，超聲15 min；同時以1∶100的茶水在80 ℃下水浴10 min。結(jié)果顯示水浴方法提取效率（第一次提取約70%）要比其他方法更好，檢測波長為278 nm的標樣色譜見圖1。

通過外標法計算兒茶素含量，公式為：

P=■

其中，P為樣品內(nèi)含物的含量（mg/g），C0為樣品內(nèi)含物的濃度，S0和S1分別為標樣和樣品的峰面積，V1為樣品定容體積，M0為樣品稱樣量。其平均值和標準差結(jié)果見表2。

2.2 主成分分析

根據(jù)表2中的分析結(jié)果，將不同地區(qū)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 11.5分析，結(jié)果見圖2和圖3，累計貢獻率為62.5%，第一主成分解釋了38.0%的變量，第二主成分解釋了24.5%的變量。結(jié)合圖3可以看出，第一主成分上，EGC和ECG是主要影響因子；第二主成分上EC、GCG和CAF起主要作用。宜昌、鶴峰地區(qū)的茶葉樣品在GC含量上要高于其他地區(qū)；赤壁市的茶葉樣品中GCG的含量相對較高。但是PCA未能較好的區(qū)分湖北不同地區(qū)的綠茶，因此將數(shù)據(jù)導(dǎo)入R studio軟件進一步分析。

2.3 貝葉斯判別分析

利用R-3.3.1軟件對湖北省六個地區(qū)茶葉的兒茶素含量做貝葉斯判別分析，得到圖4和表3的分析結(jié)果。如圖4所示，恩施和通城地區(qū)的茶葉與其他地區(qū)的茶葉之間有較好的判別分離效果，而鶴峰、黃岡、宜昌以及赤壁地區(qū)的茶葉樣品誤判較多，同時有大量交叉，區(qū)分效果不理想。由表3可知，恩施地區(qū)茶葉的判別正確率高達90.0%，區(qū)分效果十分理想，由于恩施屬于高山地區(qū)，海拔較高，以及恩施地區(qū)特有的土壤環(huán)境導(dǎo)致了恩施茶葉的特異性。赤壁、鶴峰、黃岡、通城、宜昌地區(qū)的茶葉判別正確率分別是54.5%、55.0%、84.6%、66.7%、4.8%，其中宜昌地區(qū)的茶葉樣品大量被誤判為鶴峰、黃岡以及通城地區(qū)的茶葉樣品，可能原因是宜昌地區(qū)的土壤、氣候等條件與這3個地區(qū)相似，并且這幾個地區(qū)之間茶葉的流通性較大，導(dǎo)致了這幾個地區(qū)茶葉難以區(qū)分，大量的宜昌茶葉被誤判。

3 小結(jié)與討論

已有試驗發(fā)現(xiàn)綠茶中有多種特征物質(zhì)，其中茶多酚是綠茶中多酚類物質(zhì)的總稱，以兒茶素為主的黃烷醇類化合物占茶多酚總量的60%～80%。本試驗以兒茶素與咖啡因為研究對象，通過高效液相色譜方法分析來自湖北不同地區(qū)的綠茶樣品，比較了主成分分析法與貝葉斯判別分析法在區(qū)分湖北茶葉產(chǎn)地上的有效性。結(jié)果表明，主成分分析法無法區(qū)分來自湖北不同地區(qū)的茶葉，貝葉斯判別分析法對恩施地區(qū)茶葉的判別正確率高達90.0%，對宜昌茶葉的誤判率最高，對湖北茶葉有一定的區(qū)分效果。由于此次采樣品種太多太繁雜，茶葉品種、產(chǎn)地、海拔、氣候等數(shù)據(jù)不全，無法準確解釋試驗結(jié)果。因此，后續(xù)試驗需要重點收集茶葉產(chǎn)地的具體信息（品種、海拔、溫度、降水量等），在此基礎(chǔ)上結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法以研究湖北不同地區(qū)茶葉的差異。

參考文獻：

[1] 童華榮，金孝芳，龔雪蓮.茶多酚感官性質(zhì)及其對茶葉澀味的影響[J].茶葉科學(xué)，2006（2）：79-86.

[2] 陳美麗，唐德松，龔淑英，等.綠茶滋味品質(zhì)的定量分析及其相關(guān)性評價[J].浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2014（6）：670-678.

[3] 程 煥，賀 瑋，趙 鐳，等.紅茶與綠茶感官品質(zhì)與其化學(xué)組分的相關(guān)性[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2012（S1）：375-380.

[4] 廖鴻雁，戴前穎，齊 燦，等.幾種名優(yōu)茶的滋味化學(xué)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：6510-6512，6515.

[5] KANWAR J，TASKEEN M，MOHAMMAD I，et al. Recent advances on tea polyphenols[J].Front Biosci（Elite Ed），2012，4：111-131.

[6] SENANAYAKE S N. Green tea extract：Chemistry，antioxidant properties and food applications-A review[J].Journal of Functional Foods，2013，5（4）：1529-1541.

[7] 周 健，成 浩，賀 巍，等.基于近紅外的PLS量化模型鑒定西湖龍井真?zhèn)蔚难芯縖J].光譜學(xué)與光譜分析，2009，29（5）：1251-1254.

[8] MA T，HUANG C，MENG X，et al. Fingerprint analysis of Hawk-tea by high-performance liquid chromatography[J].Food Chemistry，2011（2）：551-556.

[9] WANG Y X，LI Q，WANG Q，et al. Simultaneous determination of seven bioactive components in oolong tea camellia sinensis： Quality control by chemical composition and HPLC fingerprints[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012（60）：256-260.

[10] LIN J，ZHANG P，PAN Z，et al. Discrimination of oolong tea （Camellia sinensis） varieties based on feature extraction and selection from aromatic profiles analysed by HS-SPME/GC-MS[J].Food Chemistry，2013，141（1）：259-265.