趙增成+宋敏訓(xùn)+李桂明+馮敏燕+楊世發(fā)+黃中利+傅劍+林樹乾

摘要：為測定銀翹散對禽流感病毒（AIV）的抑制作用，將不同濃度的銀翹散煎煮液分別與H9、H5亞型AIV在體外混合作用30 min后，接種SPF雞胚，測定雞胚的死亡率及尿囊液中AIV的血凝價，并采用RT-PCR法對1 g/mL試驗組雞胚進(jìn)行H9N2病毒檢測。結(jié)果表明，藥物濃度在0.2500 g/mL及以上時，H9N2試驗組雞胚存活率為100%，病毒血凝價為零，藥物濃度為1 g/mL時，RT-PCR檢測無目的條帶出現(xiàn)；藥物濃度在0.5000 g/mL及以上時，H5N1試驗組雞胚存活率為100%，病毒血凝價為零。因此，銀翹散煎煮液在體外對禽流感病毒具有明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞：銀翹散；禽流感病毒；體外抗病毒試驗

中圖分類號：S853.75文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0107-04

Abstract In order to determine the inhibitory effect of Yinqiao San on avian influenza virus （AIV），its different concentrations of decoction were respectively mixed with H9 and H5 subtype of AIV in vitro for 30 minutes，and then inoculated SPF chick embryos.The mortality of chick embryo and the hemagglutination titer of AIV were determined， and the H9N2 virus in chicken embryo was tested by RT-PCR.The results showed that the embryo survival rate was 100% in the H9N2 test group and the hemagglutination was 0 when the drug concentration was ≥0.2500 g/mL.The aimless bands were detected by RT-PCR when the drug concentration was 1.0000 g/mL.When the drug concentration was ≥0.5 g/mL， the survival rate of H5N1 test group was 100%， and the hemagglutination titer was 0.Therefore，Yinqiao San decoction has obvious inhibitory effect on avian influenza virus in vitro.

Keywords Yinqiao San； AIV；In vitro antiviral test

《溫病條辨》為清代著名溫病學(xué)家吳鞠通的代表著作，書中所載銀翹散是辛涼解表劑的經(jīng)典代表方，具有辛涼透表、清熱解毒之功效，被廣泛運(yùn)用于溫?zé)峒膊〉姆乐蝃1-4]。長期以來，大量臨床實踐和文獻(xiàn)資料證明，銀翹散對于防治急性感染性疾病有其獨(dú)特功效，對許多傳染病，如流行性感冒、麻疹、手足口病、流行性乙型腦炎、流行性腮腺炎、流行性出血熱、病毒性肝炎、瘧疾、細(xì)菌性痢疾、急性支氣管炎、肺炎、敗血癥、艾滋病等，均取得了較好療效[5-8]。為探討銀翹散對禽流感的防治效果，筆者應(yīng)用雞胚接種試驗對銀翹散體外抗禽流感病毒的抑制作用進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物 銀翹散，購自濟(jì)南宏濟(jì)堂藥店。

1.1.2 病毒 H9、H5亞型AIV株，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所禽病研究室提供。

1.1.3 雞胚 9～11日齡SPF雞胚，由山東昊泰實驗動物繁育有限公司提供。

1.1.4 1%雞紅細(xì)胞懸液 采取成年健康SPF公雞血液，以3.8%枸椽酸鈉溶液（1∶4）抗凝，加5倍生理鹽水洗滌，2 000 r/min離心5 min，洗滌3次，取沉淀紅細(xì)胞用生理鹽水稀釋為1%雞紅細(xì)胞懸液。

1.1.5 儀器 孵化器，購自北京海江孵化設(shè)備制造有限公司；PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀均購自杭州博日科技有限公司。

1.1.6 試劑 TRIzol、2×One-step Mix、One-step Enzyme Mix、引物、Rnase-free ddH2O、核酸染料、10×DNA loading buffer，均購自生工生物工程（上海）有限公司；氯仿、異丙醇、乙醇等，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 銀翹散煎煮液制備 稱取500 g生藥置中藥煎煮機(jī)中，加水浸泡1 h，煮沸后煎煮30 min，倒出藥液。再同法煎煮一次。合并藥液，濃縮藥液至500 mL，使每毫升藥液相當(dāng)于含生藥1 g。高壓滅菌后，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 銀翹散煎煮液稀釋 將煎煮液按10 000 r/min離心5 min，吸取上清液，用蒸餾水倍比稀釋成1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、0.0625 g/mL的溶液。

1.2.3 銀翹散煎煮液調(diào)pH至中性 用pH計先測定中藥液的pH值，再取煎煮液50 mL，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0。

1.2.4 雞胚接種 取10-2稀釋的H9亞型AIV液1 mL，分別與不同稀釋濃度的中藥煎煮液1 mL在離心管中混合，室溫下作用30 min，再取混合液0.2 mL尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每組6枚雞胚。另外，將pH調(diào)至7.0的中藥液與病毒液作用后接種一組，病毒對照組接種一組，共7組。endprint

同樣，取10-4稀釋的H5亞型AIV液分別與不同濃度的中藥液等量混合作用30 min后，接種SPF雞胚。

接種后的雞胚，繼續(xù)孵化，每天定時照蛋，檢查記錄各組雞胚的死亡、存活情況。

1.2.5 雞胚AIV血凝價測定 各組死亡雞胚或最后存活雞胚均冰箱冷藏過夜后，取尿囊液，進(jìn)行血凝試驗[8]。在96孔V型凝集板上用微量移液器每孔加入生理鹽水50 μL，再吸取尿囊液50 μL于第1孔中，充分混合后再從第1孔吸50 μL至第2孔，依次作倍比稀釋，至第10孔，最后2孔分別作抗原及紅細(xì)胞對照，再吸取1%紅細(xì)胞懸液依次加入各孔，每孔50 μL ，至37℃溫箱作用20 min，判定血凝（HA）滴度。

1.2.6 H9N2禽流感病毒RT-PCR檢測 在接種H9亞型AIV的雞胚中，選取最高中藥濃度1 g/mL，對各雞胚進(jìn)行RT-PCR檢測。吸取雞胚尿囊液，分裝于2 mL離心管，10 000 r/min離心10 min，取上清液，TRIzol法提取RNA[9]。根據(jù)公開發(fā)表的H9N2禽流感病毒全基因組序列，設(shè)計上、下游引物，其中上游引物P1：5′-TCAATCAACAAACTCCACAGA-3′，下游引物P2：5′-CCACATGAAAAGAATGTTCT-3′，片段大小490 bp。RT-PCR按一步法進(jìn)行，采用20 μL反應(yīng)體系：2×One-step Mix，10 μL；One-step Enzyme Mix，1 μL；引物P1（10 μmol/L），0.5 μL；引物P2（10 μmol/L），0.5 μL；模板RNA，3 μL；Rnase-free ddH2O 加至20 μL。反應(yīng)條件：50℃ 30 min；94℃ 3 min，94℃ 20 s，50℃ 20 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。RT-PCR產(chǎn)物電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀翹散對H9 亞型AIV抑制試驗結(jié)果

由表1可知，病毒對照組雞胚72 h全部死亡，尿囊液中病毒HA平均滴度為8.3。銀翹散煎煮液濃度為1.0000、0.5000、0.2500 g/mL時，雞胚96 h后均全部存活，病毒HA平均滴度全部為零，具有明顯的抑制H9亞型AIV作用。銀翹散煎煮液在濃度為0.1250、0.0625 g/mL時，從雞胚存活率及HA效價來看，對病毒無抑制作用。銀翹散煎煮液調(diào)pH至中性后，同樣表現(xiàn)出較好的病毒抑制效果。

2.2 銀翹散對H5 亞型AIV抑制試驗結(jié)果

由表2可知，與H5亞型禽流感病毒對照組相比，從雞胚存活率和HA血凝價來看，銀翹散煎煮液在濃度為1.0000、0.5000 g/mL時，均具有明顯的抑制H5亞型AIV作用；濃度為0.2500 g/mL時，對病毒具有一定的抑制作用；濃度為0.1250、0.0625 g/mL時，對病毒無抑制作用。銀翹散煎煮液調(diào)pH至中性后，同樣表現(xiàn)出較好的抑制H5亞型AIV作用。

2.3 雞胚H9亞型禽流感病毒RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果表明，銀翹散煎煮液1.0000 g/mL試驗組，各雞胚尿囊液中均沒有檢測到H9N2亞型AIV特異性條帶，而H9N2 AIV對照組所有雞胚尿囊液中均有特異性目的條帶出現(xiàn)，大小約490 bp。檢測結(jié)果見表3，電泳圖見圖1。

3 討論與結(jié)論

3.1 通過雞胚死亡率、尿囊液中病毒血凝價檢測結(jié)果來看，銀翹散煎煮液在濃度0.2500 g/mL及以上時，對H9亞型AIV具有較強(qiáng)的抑制效果；藥物濃度在0.5000 g/mL及以上時，對H5亞型AIV具有明顯的抑制效果。RT-PCR檢測結(jié)果表明，當(dāng)銀翹散煎煮液濃度為1.0000 g/mL時，可完全抑制H9亞型AIV。試驗表明，銀翹散煎煮液在體外對禽流感病毒具有確實的抑制作用。

3.2 在中藥體外抗病毒試驗中，由于中藥液pH值不同，可能會對試驗結(jié)果造成影響。銀翹散煎煮液pH值為5.0左右，呈弱酸性。在體外抗病毒試驗中，各試驗組雖然表現(xiàn)出較好的抗病毒結(jié)果，但也有可能與藥液呈酸性抑制了病毒活性有關(guān)。為此，筆者將銀翹散煎煮液pH調(diào)至中性，發(fā)現(xiàn)其仍表現(xiàn)出較好的抗AIV效果，這說明銀翹散的體外抗AIV作用與pH值無關(guān)，而是自身藥效的結(jié)果。

3.3 按照溫病學(xué)理論，現(xiàn)代臨床上的多種急性感染性疾病都屬于溫病范疇[10]。銀翹散具有疏風(fēng)散熱、清熱解毒功能，被廣泛運(yùn)用于溫病的治療，尤其在一些傳染性疾?。ㄈ缌餍行愿忻暗龋┥先〉昧溯^好療效[11，12]。本研究為銀翹散防治禽流感等家禽疫病提供了藥理藥效學(xué)依據(jù)，為挖掘這一寶貴醫(yī)藥資源，并進(jìn)一步研發(fā)新獸藥口服液奠定了基礎(chǔ)。

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