蔡遜 王世杰 馬丹丹 傅濤 劉勇 孫康

·論 著·(實(shí)驗(yàn)研究)

回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對(duì)2型糖尿病大鼠血糖及腸道屏障的影響及機(jī)制研究

蔡遜 王世杰 馬丹丹 傅濤 劉勇 孫康

目的觀察回腸轉(zhuǎn)位術(shù)(ileal transposition, IT)對(duì)2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2, GLP-2)、D乳酸及二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)的影響，探討IT對(duì)T2DM大鼠血糖和腸黏膜屏障的影響及相關(guān)機(jī)制。方法隨機(jī)數(shù)字表法將60只T2DM大鼠分為IT組和假手術(shù)組(Sham組)，每組30只。觀察并測(cè)定兩組大鼠術(shù)前及術(shù)后3d、1周(w)、2w、4w、6w、8w FBG、GLP-1、GLP-2、D乳酸、DAO水平的變化。結(jié)果與術(shù)前比較，IT組T2DM大鼠術(shù)后3d FBG、GLP-1及GLP-2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)后1w、2w、4w、6w、8w FBG明顯下降(t1w=6.148,P1w<0.001 ;t2w=8.650,P2w<0.001 ;t4w=9.569,P4w<0.001;t6w=11.201,P6w<0.001;t8w=12.424,P8w<0.001)，GLP-1及GLP-2均顯著升高[(GLP-1:t1w=-12.794,P1w<0.001;t2w=-18.477,P2w<0.001;t4w=-24.252,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)、 (GLP-2:t1w=-12.305,P1w<0.001;t2w=-14.708,P2w<0.001;t4w=-28.142,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)]。與術(shù)前相比，IT組術(shù)后3 d DAO及D-乳酸均較術(shù)前明顯升高(DAO:t3d=-46.223,P3d<0.001；D-乳酸:t3d=-6.439,P3d<0.001)，但術(shù)后1w、2w、4w、6w、8w DAO及D-乳酸與術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相同條件下，Sham組上述指標(biāo)均未見明顯變化(P>0.05)。結(jié)論IT通過刺激GLP-1和GLP-2分泌增加來發(fā)揮降低血糖和保護(hù)腸道屏障功能的作用。

回腸轉(zhuǎn)位術(shù)； 2型糖尿??； 大鼠； 胰高血糖素樣肽； 腸道屏障

胃腸道除消化、吸收、分泌功能及免疫調(diào)節(jié)外，還具有重要的屏障功能[1]。在正常情況下，人體腸黏膜能有效阻止腸道內(nèi)細(xì)菌、毒素及有害物質(zhì)侵入體內(nèi)[2]。但在手術(shù)、創(chuàng)傷、休克、嚴(yán)重感染、膿毒癥等應(yīng)激情況下，胃腸道黏膜易受到攻擊和損害而發(fā)生屏障功能障礙[3]。一般情況下，2型糖尿病(lype 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠在回腸轉(zhuǎn)位術(shù)(ileal transposition, IT)這一手術(shù)應(yīng)激情況下，胃腸道黏膜易受損而發(fā)生屏障功能障礙，但是國(guó)內(nèi)外卻未見相關(guān)報(bào)道。因此我們推測(cè)：IT可能通過其他方式保護(hù)T2DM大鼠的腸黏膜屏障功能?；谝陨贤茰y(cè)及本課題組前期研究的基礎(chǔ)[4-5]，我們選擇T2DM大鼠模型進(jìn)行回腸轉(zhuǎn)位術(shù)手術(shù)干預(yù)，旨在分析回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對(duì)大鼠的降糖效果作用，并通過分析手術(shù)前后胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)的變化，探討其可能的機(jī)制，以期為IT進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。更為重要的是通過觀察IT對(duì)胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2, GLP-2)、D乳酸及二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)的影響，探討IT對(duì)T2DM大鼠腸黏膜屏障的影響及機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的購(gòu)買、飼養(yǎng)、模型建立及分組

SPF級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠60只，6周齡，體重180～200 g，購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫20 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，每日光照12 h，自由攝食飲水。建模方法參考文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道：高脂高糖喂養(yǎng)4周(w)，腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ) 35 mg/kg。注射后3 d尾靜脈測(cè)大鼠血糖，以空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)值≥16.7 mmol/L，并穩(wěn)定10 d，為大鼠造模成功。T2DM大鼠模型隨機(jī)分為2組，分別為：IT組和假手術(shù)組(Sham組)，每組30只大鼠以1～30隨機(jī)編號(hào)。

二、手術(shù)分組及處理

兩組糖尿病大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h，均用10%水合氯醛按0.5 ml/100 g體重進(jìn)行腹腔注射麻醉。仰臥位固定四肢及頭部，用聚維酮碘(碘伏)常規(guī)消毒鋪巾，于上腹部正中切口進(jìn)腹，切口長(zhǎng)3～4 cm。①IT組：自回盲部近端5～10 cm處截取約6～10 cm回腸段，保留小腸系膜，距屈氏韌帶5～10 cm橫斷空腸，將所截取回腸段按原來的蠕動(dòng)方向做兩個(gè)端端吻合間置于橫斷的空腸中間。吻合完畢，生理鹽水沖洗腹腔，逐層關(guān)腹。吻合腸管使用6-0的可吸收縫線連續(xù)縫合，吻合口前層和后層漿肌層包埋各兩針，關(guān)腹使用4-0的絲線縫合。詳見圖1。②假手術(shù)組：僅行腹壁切開縫合術(shù)。

三、觀測(cè)指標(biāo)及方法

手術(shù)當(dāng)天禁食禁水，術(shù)后第1天禁食不禁水，術(shù)后第2天恢復(fù)術(shù)前的飲食。測(cè)量術(shù)前及術(shù)后3d、1w、2w、4w、6w、8w回腸轉(zhuǎn)位組和假手術(shù)組的FBG、GLP-1、GLP-2、DAO和D-乳酸水平。2組大鼠隔夜禁食12 h，斷尾或眼球摘除取血1.0 ml，血糖儀檢測(cè)FBG，靜置離心，分離血清按照ELISA試劑盒說明書對(duì)GLP-1、GLP-2、DAO和D-乳酸數(shù)值進(jìn)行檢測(cè)。

A.上腹部正中切口進(jìn)腹;B.截取約6cm回腸;C.端端吻合圖1 回腸轉(zhuǎn)位術(shù)

表1 不同時(shí)間兩組大鼠FBG、GLP-1及GLP-2水平比較±s)

注：與術(shù)前比較，*P<0.001

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組大鼠的FBG、GLP-1及GLP-2水平比較

同組內(nèi)與術(shù)前比較，IT組大鼠術(shù)后3d FBG、GLP-1及GLP-2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)后1w、2w、4w、6w、8w FBG較術(shù)前顯著下降(t1w=6.148,P1w<0.001;t2w=8.650,P2w<0.001;t4w=9.569,P4w<0.001;t6w=11.201,P6w<0.001;t8w=12.424,P8w<0.001)、GLP-1及GLP-2均顯著升高(GLP-1:t1w=-12.794,P1w<0.001;t2w=-18.477,P2w<0.001;t4w=-24.252,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001；GLP-2:t1w=-12.305,P1w<0.001;t2w=-14.708,P2w<0.001;t4w=-28.142,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)。見表1。

二、兩組大鼠的血漿DAO及D-乳酸水平比較

術(shù)前2組大鼠空腹D-乳酸及DAO差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與術(shù)前相比，IT組術(shù)后3 d DAO及D-乳酸均較術(shù)前明顯升高(DAO:t=-46.223,P<0.001)、(D-乳酸:t=-6.439,P<0.001)，術(shù)后1w、2w、4w、6w、8wDAO及D-乳酸與術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相同條件下，Sham組卻無此變化。見表2。

表2 不同時(shí)間兩組大鼠DAO及D-乳酸水平比較±s)

注：與術(shù)前比較，*P<0.001

討 論

Pories等[8]于1995年報(bào)道稱胃轉(zhuǎn)流術(shù)對(duì)T2DM病人的血糖具有顯著的改善作用，且無需采取任何降糖措施維持，開創(chuàng)外科手術(shù)治療T2DM的新途徑。近年來，隨著手術(shù)治療糖尿病研究的不斷深入，越來越多的新術(shù)式不斷涌現(xiàn)，目前，國(guó)外學(xué)者通過對(duì)T2DM大鼠進(jìn)行IT，取得了良好的降糖效果[9-10]。但該術(shù)式的有效性、安全性、性價(jià)比、應(yīng)用前景和進(jìn)一步的臨床應(yīng)用等仍需進(jìn)一步研究論證。因此本研究旨在探討IT對(duì)T2DM大鼠的降糖作用和對(duì)腸黏膜屏障的影響及相關(guān)機(jī)制。

IT術(shù)式操作簡(jiǎn)單，既不縮減消化道容量，也不改變消化道長(zhǎng)度和胃腸道延續(xù)性，只是通過調(diào)整腸道排序來調(diào)節(jié)機(jī)體的生理代謝，幾乎避免了其他減重代謝術(shù)式帶來的各種并發(fā)癥。被譽(yù)為是最符合代謝外科設(shè)計(jì)理念的手術(shù)方式[11]。IT可使未完全消化的食物提前進(jìn)入回腸，食物持續(xù)不斷刺激大鼠腸道L細(xì)胞分泌GLP-1和GLP-2。研究[12]認(rèn)為腸-胰島素軸中控制T2DM最核心的介導(dǎo)因子即是GLP-1。GLP-1由30個(gè)氨基酸組成，是一種末端空回腸L細(xì)胞分泌的腸肽激素。其主要的生理功能為減少食物吸收，抑制胃動(dòng)力、胃酸分泌及胃排空，抑制胰高血糖素分泌，促進(jìn)胰島β細(xì)胞增生及胰島素合成與分泌。本研究中，術(shù)后1w、2w、4w、6w、8w FBG較術(shù)前顯著下降，GLP-1顯著升高。結(jié)果表明：IT對(duì)T2DM大鼠有顯著的降糖作用，其可能的機(jī)制是食物提前進(jìn)入回腸，刺激GLP-1分泌增加，增加胰島素分泌。與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相一致[13-14]。

哺乳動(dòng)物的組織在正常情況下既不產(chǎn)生也不代謝D-乳酸，但在腸道應(yīng)激(如手術(shù)、缺血、創(chuàng)傷、感染等)情況下，腸黏膜屏障通透性迅速增高，血中D-乳酸蓄積。故血漿D-乳酸作為腸黏膜屏障通透性的標(biāo)志物，直接反映腸黏膜通透性和屏障功能的損害程度[15-16]。血漿DAO是人類和所有哺乳動(dòng)物腸黏膜細(xì)胞胞質(zhì)中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶。當(dāng)腸黏膜細(xì)胞受損壞死時(shí)，DAO即刻釋放入血，導(dǎo)致血中活性增高。因此血DAO水平是監(jiān)測(cè)腸黏膜損傷的較好指標(biāo)[17]。本研究中，IT組術(shù)后3 d DAO及D-乳酸均較術(shù)前明顯升高，術(shù)后1w、2w、4w、6w、8w DAO及D-乳酸與術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明IT術(shù)后3d造成2型糖尿病大鼠腸黏膜受損而發(fā)生屏障功能障礙，但是隨著時(shí)間的推移，腸道屏障功能得以恢復(fù)，具體機(jī)制不明。GLP-2屬于胰高血糖素原衍生肽類，是一種由33個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，作用僅限于腸道，具有器官特異性。其主要由腸道L細(xì)胞合成、分泌，通過腎臟排泄。而腸道L細(xì)胞主要集中于回腸和結(jié)腸，其分泌受飲食、神經(jīng)和內(nèi)分泌等多種因素調(diào)節(jié)[18-19]。GLP-2主要功能有：增加腸道血供，促進(jìn)腸黏膜生長(zhǎng)，抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，增加黏膜己糖的轉(zhuǎn)運(yùn)及消化酶的表達(dá)，進(jìn)而降低腸道通透性，從而達(dá)到保護(hù)腸道屏障功能的作用[20-21]。本研究中IT組術(shù)后1～8w GLP-2較術(shù)前顯著增加。由此可見回腸轉(zhuǎn)位術(shù)使食物提前進(jìn)入回腸，持續(xù)不斷刺激GLP-2分泌，GLP-2表達(dá)增加可來保護(hù)腸道屏障功能。

綜上所述，IT通過調(diào)控GLP-1和GLP-2的表達(dá)來發(fā)揮降低血糖和保護(hù)腸道屏障功能的作用。相信隨著科研工作者不斷深入地探討和研究，IT進(jìn)一步應(yīng)用到臨床，將使廣大T2DM病人獲益。

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Effectofilealtranspositionsurgeryonbloodglucoseandintestinalbarrierinratswithtype2diabetesmellitusandpossiblemechanism

CaiXun,WangShijie,MaDandan,FuTao,LiuYong,SunKang.

DepartmentofGeneralSurgery,WuhanGeneralHospitalofPeople'sLiberationArmy,Wuhan430070,China

FuTao,Email:surgfu@sina.com

ObjectiveTo observe the effect of ileal transposition(IT) surgery on fasting blood glucose(FBG), glucagon-like peptide-1(GLP-1), glucagon-like peptide-2(GLP-2), D lactate and diamine oxidase(DAO) expression, and intestinal barrier in type 2 diabetes mellitus(T2DM) rats and the possible mechanisms.MethodsT2DM rats were randomly divided into IT surgery group(n=30) and sham operation group(n=30). The FBG, GLP-1, GLP-2, D lactate and DAO levels in the two groups were determined before and 3 days, 1 week, 2 weeks, 4 weeks, 6 weeks, 8 weeks after operation.ResultsThere was no significant difference in FBG, GLP-1 and GLP-2 before and at 3rd day after operation in IT group(P>0.05). FBG levels were significantly decreased (t1w=6.148,P1w<0.001;t2w=8.650,P2w<0.001;t4w=9.569,P4w<0.001;t6w=11.201,P6w<0.001;t8w=12.424,P8w<0.001),and GLP-1 and GLP-2 levels were significantly increased at 1w, 2w, 4w, 6w, 8w in IT group[(GLP-1:t1w=-12.794,P1w<0.001;t2w=-18.477,P2w<0.001;t4w=-24.252,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001) and (GLP-2:t1w=-12.305,P1w<0.001;t2w=-14.708,P2w<0.001;t4w=-28.142,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)]. As compared with preoperation, D lactate and DAO levels were significantly increased at 3rd day after operation in IT group[(DAO:t3d=-46.223,P3d<0.001); (D lactate:t3d=-6.439,P3d<0.001)]. There was no significant difference in D lactate and DAO levels before and at 1w, 2w, 4w, 6w, 8w after operation in IT group(P>0.05). Under the same conditions, there were no obvious changes in the above indexes in sham group(P>0.05).ConclusionsIT surgery has a significant hypoglycemic effect and can protect intestinal barrier function by stimulating the secretion of GLP-1 and GLP-2.

Ileal transposition; Type 2 diabetes mellitus; Rats; Glucagon-like peptidel; Intestinal barrier

R657.7; R587.1

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2017.06.019

湖北省衛(wèi)生計(jì)生委科研項(xiàng)目(WJ2017H0048, WJ2017H0043)

430070 武漢，中國(guó)人民解放軍武漢總醫(yī)院普通外科(蔡遜、馬丹丹、傅濤、劉勇、孫康)；南方醫(yī)科大學(xué)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院(王世杰)

傅濤，Email：surgfu@sina.com

10.16151/j.1007-810x.2016.05. 001.

2017-06-12)