王 倩, 丁 暢, 王 治, 吳 娟

(1. 江蘇省南京市胸科醫(yī)院 心內(nèi)科, 江蘇 南京, 210029; 2. 江蘇省南京市口腔醫(yī)院 牙周科, 江蘇 南京, 210008)

冠心病合并慢性牙周炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測的臨床意義

王 倩1, 丁 暢1, 王 治1, 吳 娟2

(1. 江蘇省南京市胸科醫(yī)院 心內(nèi)科, 江蘇 南京, 210029; 2. 江蘇省南京市口腔醫(yī)院 牙周科, 江蘇 南京, 210008)

冠心病; 牙周炎; 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞; 動脈粥樣硬化

炎癥反應(yīng)不僅在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(AS)斑塊的形成和發(fā)展中起著重要作用，還決定著它的穩(wěn)定性[1]。牙周炎是牙周支持組織的慢性炎癥，能夠通過被感染的牙周組織釋放炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致AS[2]。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫參與了AS的炎癥反應(yīng)過程，在促進(jìn)斑塊進(jìn)展和保持斑塊穩(wěn)定中都起到一定的作用[3-4]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的數(shù)量減少或者功能下降、甚至其分化及分布的異常都會導(dǎo)致自身免疫失調(diào)，這可能是T淋巴細(xì)胞參與AS進(jìn)展的重要作用機(jī)制[5]。本研究檢測患者的CD4+CD25+FoxP3+Treg含量以及細(xì)胞因子TGF-β1的濃度，分析冠心病合并慢性牙周炎患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及功能的變化，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月—2017年9月南京市胸科醫(yī)院心血管內(nèi)科首診疑似冠心病住院患者122例，年齡40～65歲，平均(56.74±6.82)歲，男62例，女60例。根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果和牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)將患者分為4組。對照組(C組)32例，男15例，女17例，年齡(56.48±5.93)歲，冠脈造影正常且牙周組織健康或僅有牙齦炎; 冠心病組(CHD組)28例，男15例，女13例，年齡(58.16±7.19)歲，有冠心病但牙周組織健康或僅有牙齦炎; 冠心病合并牙周炎組(CHD-P組)32例，男17例，女15例，年齡(57.40±7.47)歲; 牙周炎組(P組)30例，男15例，女15例，年齡(55.01±6.60)歲，冠脈造影正常有慢性牙周炎。

排除標(biāo)準(zhǔn): 合并感染性疾病; 應(yīng)用炎癥抑制藥物; 嚴(yán)重肝腎功能不全者; 周圍血管栓塞性疾病者; 惡性腫瘤患者; 糖尿病和風(fēng)濕性疾病; 嚴(yán)重高脂血癥(總膽固醇>6.5 mmol/L、甘油三酯>3.0 mmol/L、低密度脂蛋白>4.0 mmol/L)和高血壓病3級以上的患者。研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲取研究對象的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 冠心病的診斷: 行冠狀動脈造影并依據(jù)哈里森內(nèi)科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)診斷，冠狀動脈狹窄<50% 者為正常。冠狀動脈狹窄程度采用Gensini(GS)評分法進(jìn)行評分; 對主要冠狀動脈左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈中任何一支狹窄進(jìn)行積分: ≤25%為1.0分，26%～49%為1.5分，50%為2.0分，51%～74%為3.0分，75%為4.0分，76%～89%為6.0分，90%為8.0分，91%～98%為12.0分，99%為16.0分，100%為32.0分。

1.2.2 牙周炎的診斷: 由南京市口腔醫(yī)院同一位牙周科醫(yī)生依據(jù)患者牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齒松動等方面進(jìn)行診斷。牙周組織健康或僅有牙齦炎者列為無牙周炎。

1.2.3 標(biāo)本采集: 抽取受試者入院后第2天空腹靜脈血12 mL, 其中6 mL全血樣本送本院檢驗中心進(jìn)行常規(guī)血脂、CRP檢測; 2 mL全血樣本采用EDTA抗凝行流式細(xì)胞術(shù)檢測; 4 mL全血樣本用肝素抗凝管采集送本院中心試驗室行ELISA檢測。

1.2.4 CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T的檢測: 抽取靜脈血1 mL, 用PBS 1︰1稀釋，加入等量的人淋巴細(xì)胞分離液中, 2 200 r/min離心20 min, 取單個核細(xì)胞層，加入PBS洗滌, 1 500 r/min離心10 min去上清液; 取A(同型對照管)、B(檢測管)兩管，每管加入約5.0×105個細(xì)胞，以CD4/CD25混合抗體孵育30 min, 洗滌后加入1 mL固定/破膜工作液孵育60 min, A管加入IgG抗體，B管加入Foxp3抗體，孵育30 min, 洗滌后加入適量流式緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。試劑購自美國BD公司。

1.2.5 TGF-β1濃度的檢測: 靜脈血4 mL以4 ℃低溫離心機(jī)3 000 轉(zhuǎn)/min離心20 min, 收集血清并分裝至多個1.5 mL的EP管中，封膜，編號, -80 ℃超低溫冰箱保存待用。取上清液(血漿)用ELISA法測定TGF-β1濃度。TGF-β1ELISA試劑盒購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗; 計量資料方差齊性檢測后，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK方差分析; 相關(guān)檢驗性采用Spearman。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

C組、CHD組、CHD-P組和P組在年齡、性別、吸煙率、血壓、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、CRP等方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。CHD組的GS評分為(13.91±6.37)，較C組(2.97±1.90)和P組(2.90±1.91)顯著升高 (P<0.01)。CHD-P組的GS評分為(22.98±13.36)，較C組和P組顯著升高(P<0.01)。CHD-P組較CHD組顯著升高(P<0.01)。C組和P組無顯著差異(P=0.973)。CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T在CHD-P組中為(1.97±0.38)%，較C組(2.58±0.74)%、CHD組(2.34±0.51)%和P組(2.34±0.34)%顯著降低(P<0.01); CHD組和P組較C組下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); CHD組與P組無顯著差異(P=0.983)。CHD-P組TGF-β1水平為(13.41±2.96) μg/L, 較C組(23.32±5.60) μg/L、CHD組 (18.98±3.95) μg/L和P組(18.41±3.54) μg/L顯著降低(P<0.01)。CHD組和P組較C組均降低，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); CHD組較P組無顯著差異(P=0.606)。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血漿TGF-β1濃度與CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T呈中等相關(guān)(r=0.455,P<0.01)。

表1 4組一般資料比較

3 討 論

研究[6]認(rèn)為冠心病的主要病因是AS，但是在AS的發(fā)展過程中，細(xì)胞基質(zhì)的反應(yīng)、各種細(xì)胞因子以及生長因子的產(chǎn)生與作用，都與炎癥反應(yīng)過程很類似。AS是一種炎癥性疾病，炎性細(xì)胞浸潤是AS的重要過程。多種免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞、淋巴細(xì)胞參與AS斑塊的形成，其中T細(xì)胞在斑塊形成各個時期均發(fā)揮著重要的作用，而且斑塊部位浸潤的T細(xì)胞中最主要的是CD4+T細(xì)胞[7]。

近年來，大量的流行病學(xué)調(diào)查[8]顯示牙周炎患者發(fā)生AS的風(fēng)險增高，病因?qū)W調(diào)查[9]提示牙周炎患者罹患心血管疾病的風(fēng)險比無牙周炎患者高，重度牙周炎與血管內(nèi)膜增厚相關(guān)。牙周炎還可以導(dǎo)致血小板活化因子和脂蛋白相關(guān)性磷脂酶A2等炎癥因子釋放，它們也是已知的冠心病的危險因子，可以促進(jìn)血小板聚集，加劇冠狀動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)，使斑塊的不穩(wěn)定性加劇[10]。本研究中CHD-P組較CHD組GS評分明顯升高，提示CHD-P組較CHD組患者的冠狀動脈的狹窄程度更高，進(jìn)而預(yù)測慢性牙周炎可能與冠狀動脈粥樣硬化的進(jìn)展相關(guān)。

牙周炎引起的感染誘導(dǎo)出T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，不同亞群的T淋巴細(xì)胞在AS形成過程中的作用不同。Treg細(xì)胞是負(fù)向調(diào)節(jié)免疫T細(xì)胞，通過分泌抑炎因子IL-10和TGF-β1對炎癥反應(yīng)負(fù)調(diào)控，抑制AS的形成。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，冠心病患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)目和功能均下調(diào)，且分泌的細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1水平也隨之下降。Hagiwara等[12]研究表明，牙齦卟啉單胞菌疫苗舌下使用可緩解牙齦卟啉單胞菌感染引起的AS斑塊形成，且上調(diào)淋巴結(jié)Treg細(xì)胞數(shù)量。還有研究提示牙齦卟啉單胞菌可分泌外膜蛋白、牙齦素，當(dāng)毒力因子進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的促AS應(yīng)答反應(yīng)[13]。由此可見，Treg在T淋巴細(xì)胞參與的AS過程中可能起關(guān)鍵作用。

CD4+CD25+Foxp3+Treg是最為重要的Treg細(xì)胞。Foxp3在CD4+T細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)是Treg分化過程完成的標(biāo)志，F(xiàn)oxp3是控制Treg發(fā)育及發(fā)揮其生物功能的重要參與者[14]。Roland等[15]利用白喉毒素注射獲得選擇性缺失Foxp3的小鼠，將小鼠骨髓移植至Ldlr-/-小鼠，結(jié)果顯示Foxp3缺失后AS斑塊比對照組明顯增大，血漿膽固醇也明顯增高，證明Foxp3+Treg可通過調(diào)節(jié)脂蛋白代謝抑制AS。本研究中CHD-P組較CHD組、P組、C組的CD4+CD25+FoxP3+Treg/CD4+T均明顯下降，提示冠心病合并慢性牙周炎患者的Treg數(shù)量明顯下降，推測牙周炎加重了冠心病患者的慢性炎癥反應(yīng)、促進(jìn)了冠心病患者AS斑塊的進(jìn)展。本研究中CHD組、P組和C組的CD4+CD25+FoxP3+Treg/CD4+T組間無顯著差異。作者推測雖然CHD組和P組患者存在慢性炎癥反應(yīng)，但是該反應(yīng)相對比較輕微是不同于急性炎癥反應(yīng)的，因此與C組患者間無明顯差異，也有可能是本研究的樣本量偏小所致。

TGF-β是許多具有共同生物學(xué)特性的信號分子組成的大家族，它參與了Treg細(xì)胞分化的許多環(huán)節(jié)。TGF-β1是TGF-β1家族中的一員，它參與了冠狀動脈粥樣硬化的形成、冠狀動脈的狹窄、心肌梗死后重塑、細(xì)胞凋亡等過程，反映了Treg的功能。有研究[16]表明斑塊不穩(wěn)定的冠心病患者血清TGF-β1水平較正常人明顯降低; 心肌梗死者的血漿活性TGF-β1水平更低。由此可見，血漿TGF-β1濃度水平的降低更易于斑塊的破裂和血栓的形成。TGF-β1在AS的形成過程中是炎癥免疫調(diào)節(jié)和斑塊穩(wěn)定因子[17]。本研究中CHD-P組、CHD組、P組的TGF-β1水平均比C組降低, CHD-P組的TGF-β1水平較CHD組進(jìn)一步下降。另外，本研究提示患者的血漿TGF-β1水平與Treg含量呈中等相關(guān)。作者認(rèn)為，牙周炎與冠心病都存在慢性炎癥反應(yīng)，慢性牙周炎導(dǎo)致了冠心病患者TGF-β1水平的進(jìn)一步下降，繼而引起 Treg的含量和功能的降低，破壞了AS斑塊的穩(wěn)定性。

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R 541.4

A

1672-2353(2017)24-142-03

10.7619/jcmp.201724059

2017-10-10

國家自然科學(xué)基金項目(81570365); 南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項目(YKK15165)

丁暢